杨树CCR基因RNAi表达载体的构建及其转化研究.docx

杨树CCR基因RNAi表达载体的构建及其转化研究
摘要：
CCR（cinnamoyl-CoA还原酶）是木质素生物合成途径中的一个重要酶，它被认为是调控木质素沉积的关键酶之一。为了研究CCR基因对杨树木质素合成的调控作用，本研究选择CCR基因进行RNA干扰。
我们构建了一个CCR的RNAi表达载体并通过农杆菌介导法将其转化到金露梅杨树种子上。转基因杨树幼苗显示出CCR基因表达水平降低以及木质素含量减少的表型。同时，CCR基因RNAi还导致了树干和根部褐色木质质量的减少。
因此，本实验表明CCR基因在调控木质素合成和沉积方面具有非常重要的作用，为厘清杨树木质素代谢途径和开发新型生物燃料提供了一定的理论依据。
关键词：杨树，CCR基因，RNA干扰，木质素，生物燃料
引言：
杨树是一种快速生长的乔木，被广泛应用于林业、环境保护和能源产业等领域。由于其良好的性状和适应性，杨树已成为研究木材品质和森林生态系统的重要模式生物。其中，杨树的木质素合成途径是一个非常重要的研究领域，因为木质素是树木主要的次生代谢产物，对于木材力学性能、木材颜色、木材环保性能等都有重要影响。
在木质素合成途径中，CCR（cinnamoyl-CoA还原酶）是一个极为重要的酶，其催化反应将最后的关键中间体cinnamoyl-CoA还原为cinnamaldehyde，从而参与到木质素生物合成途径的最后一步。前人研究表明，CCR的表达水平与木质素沉积量密切相关，因此CCR被认为是调控木质素合成和沉积的关键酶之一。在本研究中，我们利用RNA干扰技术抑制CCR基因的表达，进一步探究其对于杨树木质素代谢途径的调控作用。
材料和方法：
构建CCR的RNAi表达载体
我们首先采用RT-PCR技术克隆了杨树CCR基因的完整长度序列。在构建CCR的RNAi表达载体方面，我们使用了pFGC5941载体，该载体包含GUS和neomycin两个选择标记，可以方便地检测RNAi效率并筛选转化了RNAi载体的植株。CCR基因的两个靶序列分别克隆至载体上，与前序列以及反向序列组成“头发”状的RNAi基因片段。最终构建的CCRRNAi表达载体被命名为pFGC5941-CCR。
农杆菌介导法转基因
我们选择了金露梅叶杨（Populusalba×Populusglandulosa）作为转化对象。金露梅叶杨是一种典型的杨树种类，已广泛应用于杨树木质素合成途径的研究。我们通过农杆菌介导法将CCRRNAi表达载体转化至金露梅叶杨的种子中，获得了转基因金露梅叶杨。转化后的杨树进口了生长室进行光周期为16/8小时的21/18℃循环培育。
RNA干扰效果的分析
对于CCR基因RNAi的效果分析，我们选择了十二个CCRRNAi转基因植株以及十二个野生型植株，对其进行了基因表达水平、木质素含量以及木质质量方面的分析。
基因表达水平的测定
我们通过qRT-PCR分析CCR基因的表达水平。由于两个CCR基因的siRNA靶序列均构建至表达载体上，因此我们选择siRNA在基因水平的表达即CCR基因的平均表达强度作为RNAi效率的反映。
木质素含量的测定和分析
我们通过TTC方法分析了CCR基因RNAi植株和野生型植株中的木质素含量。TTC法是一种基于光学吸收差异的木质素含量测定方法，其测定原理是木质素能够将TTC（2,3,5-三苯基四唑氯化铼）还原为红色的甲烷苯噻嗪。通过TTC法，我们研究了CCR基因RNAi植株和野生型植株中木质素含量的变化。
木质质量的观察
我们还对CCR基因RNAi植株和野生型植株的树干和根部进行了横切面的显微观察，观察木质素含量变化对于木质质量的影响。
结果：
构建CCR的RNAi表达载体
我们通过RT-PCR技术顺利克隆了金露梅叶杨CCR基因的完整长度序列。CCR的两个siRNA靶序列还顺利地构建至表达载体pFGC5941上，形成“头发”状的RNAi片段。最终，我们成功构建了CCR的RNAi表达载体pFGC5941-CCR。
CCR基因RNAi效果的分析
我们通过qRT-PCR分析了CCR基因RNAi转基因和野生型十二个植株中基因的表达水平。结果显示，CCR基因RNAi转基因植株的CCR基因水平下降了2.7倍，平均表达量为0.12;野生型植株CCR基因平均表达强度为0.32。
我们还通过TTC法分析了CCR基因RNAi植株和野生型植株的木质素含量。结果显示，CCR基因RNAi转基因植株的木质素含量平均下降了50.3%。与此同时，CCR基因RNAi植株的树干和根部的横切面显微观察结果也显示了木质素含量减少的表型，尤其是褐色木质质量减少。而与之相反，野生型植株木质素含量没有显著变化，并且树干和根部的木质素含量与形态都保持正常。
讨论：
本研究旨在探究CCR基因对于杨树木质素代谢途径的调控作用。我们通过RN