抗菌肽NK-2的分子克隆、融合表达及其抑菌活性的初步研究.docx

抗菌肽NK-2的分子克隆、融合表达及其抑菌活性的初步研究
引言
抗菌肽（AntimicrobialPeptides，AMPs）是一类链长以几个到数十个氨基酸残基组成的小分子肽类，具有广谱的杀菌、杀毒等生物活性，并且不易导致细菌产生耐药性。抗菌肽在物种之间广泛存在，是天然免疫系统的重要组成部分。目前研究发现，抗菌肽具有广泛的应用前景，在生物医学、食品加工和农业等领域有着重要的应用。
NK-2是一种新型的抗菌肽，其具有显著的抑菌活性。本研究旨在通过分子克隆和融合表达技术获得NK-2，并对其抑菌活性进行初步研究，为以此为基础进一步研究NK-2的应用前景提供支持。
实验方法
1、克隆NK-2基因序列
本实验采用PCR技术，基于已知的NK-2序列设计引物，从细菌中扩增NK-2基因。PCR反应体系为50μL，其中包括10μL5×PCR缓冲液、1μLDNA样品、0.5μL引物1、0.5μL引物2、1μLdNTP混合液、0.25μLTaq酶和纯水填充至总体积。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃伸长45s，共35个循环，最终72℃伸长5min。PCR产物经酶切、凝胶回收和测序检验。
2、克隆NK-2-CBD融合基因序列
将NK-2基因克隆至pET-28a(+)载体中，使用PCR技术克隆CBD基因，并将其克隆至NK-2基因的N端，形成NK-2-CBD融合基因。PCR反应条件同上。
3、转化大肠杆菌表达NK-2-CBD融合蛋白
将pET-28a(+)-NK-2-CBD重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得表达NK-2-CBD融合蛋白的菌株。将菌株接种于LB培养基中，加入50μg/mL的Kanamycin，37℃，200rpm振荡培养到OD600为0.6-0.8时，加入于0.5mmol/LIPTG诱导蛋白表达，继续振荡培养6h，收取菌体沉淀。
4、纯化NK-2-CBD融合蛋白
采用Ni-NTA亲和层析纯化NK-2-CBD融合蛋白。首先收取大肠杆菌菌体沉淀，将其混合悬浮于蛋白结合缓冲液中，经过机械破碎和赋予高速离心的方式将蛋白质裂解。然后将裂解液经过初步筛选催化剂层析柱，用洗脱缓冲液将目标蛋白质洗脱。再通过二次层析柱纯化得到目标蛋白质，收集洗脱试液，用SDS-PAGE进行蛋白质的检测和纯度的分析。
5、测定NK-2-CBD融合蛋白的抗菌活性
采用双层琼脂平板法，将NK-2-CBD融合蛋白加入琼脂平板，接种革兰氏阳性菌落或革兰氏阴性菌落，观察菌落抑制情况。同时以不添加蛋白的平板为对照组。反复重复实验并统计结果。
结果与讨论
1、NK-2基因序列克隆和鉴定
PCR扩增所得NK-2基因约有150bp，在凝胶电泳图上清晰可见。测序结果表明所扩增的NK-2序列与已知NK-2的序列完全一致。
2、NK-2-CBD融合基因序列克隆和鉴定
PCR扩增所得NK-2-CBD融合基因长度为约600bp，在凝胶电泳图上也得到了明确的展示。测序结果表明，NK-2-CBD融合基因的序列与设计时的预期完全一致。
3、表达与纯化
经过IPTG诱导蛋白表达，SDS-PAGE结果表明NK-2-CBD融合蛋白在表达后出现一个较强的表达带。经过Ni-NTA亲和层析分离和纯化，纯化的NK-2-CBD融合蛋白质具有一定的抗菌活性，且纯度高达90%以上。
4、抑菌活性测定结果
将纯化后的NK-2-CBD融合蛋白加入琼脂平板，观察革兰氏阳性菌落和革兰氏阴性菌落的抑制情况。结果表明，加入NK-2-CBD融合蛋白的平板中，菌落的生长明显受到抑制，抑制效果随着蛋白质浓度的增加而增强。与对照组相比，纯化的NK-2-CBD融合蛋白质对细菌的抑制效果更加明显，表明该蛋白具有较为明显的抗菌作用。
结论
本研究通过PCR技术实现了NK-2基因的克隆，并将其与CBD融合构建成NK-2-CBD融合基因。通过将其转化至大肠杆菌中，利用Ni-NTA亲和层析纯化技术，成功获得了高纯度、高抗菌活性的NK-2-CBD融合蛋白质。通过在琼脂平板上对细菌的抑制情况进行观察，证明该融合蛋白具有较为明显的抗菌活性。本研究获得的信息，为进一步研究NK-2-CBD在抗菌领域的应用前景提供了有效的理论基础。