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小类泛素修饰蛋白的表达纯化和抗体制备
泛素是一种小分子蛋白，在细胞中发挥重要的调节作用。它可以与蛋白质结合形成泛素修饰蛋白，从而参与细胞生长、分裂、DNA修复、细胞凋亡等生物学过程。泛素修饰蛋白的研究对于深入理解这些生物学过程具有重要意义。本文将着重介绍如何表达纯化小类泛素修饰蛋白，并制备相应的抗体。
一、小类泛素修饰蛋白的表达
小类泛素修饰蛋白包括SUMO（SmallUbiquitin-likeModifiers）和NEDD（NeuralprecursorcellExpressedDevelopmentallyDown-regulated）等，它们的结构与泛素相似，但功能略有不同。SUMO主要参与核转运、基因表达和细胞周期调控等过程，而NEDD主要参与蛋白质降解和信号传导等过程。下面将介绍如何表达小类泛素修饰蛋白。
1.SUMO的表达
SUMO的表达一般利用原核表达系统E.coli。在E.coli中，SUMO可作为融合蛋白与目的蛋白共同表达。常用的表达载体有pGEX、pET等。其中，pGEX和pET载体分别具有GST（GlutathioneS-transferase）和His标签，可用于GST-SUMO或His-SUMO的表达。
表达步骤如下：
（1）构建表达载体：将SUMO基因克隆入带有适当启动子和选择性抗性的原核表达载体中。
（2）转化至宿主菌：将重组载体转化至大肠杆菌宿主菌中。
（3）诱导表达：在IPTG或其他诱导剂的刺激下，启动子会促使载体中的SUMO基因以融合的形式表达。
（4）提取蛋白：利用细菌破碎液或其他方法提取蛋白质，然后使用亲和柱进行纯化。可以通过Westernblot、SDS-PAGE等方法检测SUMO的表达。
2.NEDD的表达
NEDD的表达与SUMO略有不同。常见的表达系统包括原核表达系统E.coli、酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统。其中，E.coli是最常用的表达系统。由于NEDD与E1酶以及E2酶的结合能力不太强，因此通常需要将NEDD与E1和E2融合表达。
表达步骤如下：
（1）构建表达载体：将NEDD、E1酶和E2酶基因克隆入相应的表达载体中。
（2）转化至宿主菌：将重组载体转化至大肠杆菌宿主菌中。
（3）诱导表达：在IPTG或其他诱导剂的刺激下，载体中的基因会表达。可以通过Westernblot、SDS-PAGE等方法检测NEDD的表达。
（4）提取蛋白：利用细菌破碎液或其他方法提取蛋白质，然后使用亲和柱进行纯化。
二、小类泛素修饰蛋白的纯化
1.SUMO的纯化
纯化目的蛋白前，先要将工程菌破碎，然后对细胞裂解物进行提取。目前SUMO纯化常使用的方法主要包括：
（1）亲和纯化：将GST或His标签与SUMO进行融合表达，然后利用GlutathioneSepharose4B或Ni-NTAagarose进行亲和纯化。亲和柱一般在4℃条件下洗脱，然后再用ElutionBuffer冲洗。
（2）离子交换层析：将细胞裂解物注入经过平衡的离子交换柱（如DEAESepharose）中，并用一些不同浓度的NaCl洗脱。SUMO在NaCl浓度较高的情况下洗脱。
（3）毒素联萌层析法：将含有SUMO的融合蛋白与S肽融合的毒素一起注入层析柱中，然后使用抗S肽抗体进行纯化。不同于亲和柱，这种方法可以在室温条件下进行。
2.NEDD的纯化
NEDD的纯化方法主要有硫酸铵沉淀法、柱式层析法等。由于NEDD与E1和E2的结合能力不太强，因此通常需要将NEDD与E1和E2融合表达。具体的纯化步骤如下：
（1）对死细胞进行裂解：一般采用超声波等方法将重组菌内表达的蛋白质裂解。
（2）亲和层析：将重组蛋白采用Ni-NTA层析纯化。
（3）离子交换层析：将Ni-NTA洗脱液中的NEDD进行富集，然后进行进一步纯化。
（4）毒素联萌层析：借助毒素联萌层析可实现NEDD的纯化，该方法不依赖于特殊的结构标记。
三、小类泛素修饰蛋白的抗体制备
对于小类泛素修饰蛋白的研究，抗体是一种重要的工具。下面将介绍制备小类泛素修饰蛋白的抗体的具体步骤。
1.重组蛋白表达
选择一个适合表达重组蛋白的载体，将NEDD或SUMO基因克隆进去，再用重组技术表达蛋白质。其中，使用E.coli或酵母表达系统对蛋白进行表达是常见的方法，当然还可以采用哺乳动态细胞表达系统。
2.纯化重组蛋白
根据所需纯化的蛋白情况采用对应的层析方法进行纯化。
3.免疫动物
通常选择小鼠或兔子作为动物模型，将纯化后的重组蛋白作为抗原注射。
4.血清收集和抗体纯化
7-10天后从小鼠或兔子身上收集血清，利用碳酸盐酯或硫酸铵进行富集，然后使用蛋白A/G/ProteinL树脂等进行纯化。最终得到抗体，可在Westernblot、ELISA等实验中应用。
总结
小类泛素修饰蛋白的表达