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家蚕Bmbuffy基因的克隆及其表达分析
摘要
本研究旨在克隆家蚕（Bombyxmori）中的Bmbuffy基因，并对其进行表达分析。首先，通过PCR技术从家蚕cDNA中扩增得到了完整的Bmbuffy基因序列。随后，利用qPCR方法对家蚕不同组织中Bmbuffy基因的表达情况进行了测定，结果表明该基因在家蚕中广泛表达，尤其在脑、中肠和脂肪体中的表达量较高。最后，利用FISH技术对Bmbuffy基因在家蚕卵巢中的表达及定位进行了研究，结果表明Bmbuffy基因主要在卵巢卵母细胞和滋养细胞中表达，并与染色体有明显的定位关系。
关键词：家蚕；Bmbuffy基因；克隆；表达分析；FISH技术
Abstract
TheaimofthisstudywastoclonetheBmbuffygeneinthesilkworm(Bombyxmori)andtoanalyzeitsexpression.First,thecompletesequenceoftheBmbuffygenewasamplifiedfromsilkwormcDNAusingPCRtechnology.Then,theexpressionoftheBmbuffygeneindifferenttissuesofthesilkwormwasmeasuredusingqPCR,andtheresultsshowedthatthegenewaswidelyexpressedinthesilkworm,especiallyinthebrain,midgut,andfatbody.Finally,theexpressionandlocalizationoftheBmbuffygeneinthesilkwormovarywerestudiedusingFISHtechnology,andtheresultsshowedthatthegenewasmainlyexpressedintheoocytesandnursecellsoftheovaryandhadaclearpositioningrelationshipwiththechromosomes.
Keywords:Silkworm;Bmbuffygene;cloning;expressionanalysis;FISHtechnology
引言
家蚕是我国传统的重要经济昆虫，其产丝性能是维持世界丝绸生产的关键之一。因此，了解家蚕生物学特性对于提高其产丝能力具有重要的意义。Bmbuffy基因是家蚕中一个重要的基因，其功能与昆虫的发育以及免疫反应密切相关。目前，对Bmbuffy基因的研究主要集中在其序列和基因结构的鉴定方面，对其在家蚕中的表达及定位研究还较少。因此，本研究旨在克隆家蚕中的Bmbuffy基因并对其表达情况进行分析，为探究该基因在家蚕发育及免疫过程中的作用提供基础数据。
材料与方法
材料
本研究使用家蚕作为研究对象，家蚕幼虫和成虫均由中国农业科学院蚕业研究所提供。Trizol试剂盒和PrimeScriptRTMasterMixKit用于RNA提取和cDNA合成。PCR扩增则采用TaqDNA聚合酶及相关试剂。
方法
1.Bmbuffy基因的克隆
首先，从家蚕的总RNA中提取出1μg的RNA作为RT-PCR反应的模板。以Bmbuffy已知的核苷酸序列设计外显子特异性引物和内含子引物，并使用PCR扩增出Bmbuffy基因的完整序列。PCR反应体系和条件均按相关试剂盒的说明操作。扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并进行测序确认。
2.Bmbuffy基因的表达分析
将家蚕的不同组织（包括脑、中肠、脂肪体、卵巢、精巢、繁殖道等）分别取出，总RNA分离并通过PrimeScriptRTMasterMixKit建立起cDNA模板。针对不同组织中的Bmbuffy基因，设计不同的特异性引物，使用qPCR技术进行表达量的测定。反应体系为20μL，引物浓度为0.5μM，每个样品进行三次重复，数据通过2-ΔΔCt法进行统计分析。
3.Bmbuffy基因在卵巢中的表达及定位分析
收集家蚕成虫的卵巢组织，分别放置于3.7%甲醛溶液中固定。然后，通过FISH技术进行Bmbuffy基因的检测。首先，利用Bmbuffy特异性引物针对该基因的mRNA进行荧光标记。然后，将标记后的探针与固定的卵巢组织进行杂交，最后在荧光显微镜下观察标记信号的分布情况。同时，通过DAPI染色对染色体进行染色，以比对Bmbuffy基因和染色体的位置关系。
结果
1.Bmbuffy基因的克隆
利用PCR技术从家蚕中克隆得到一个完整的Bmbuffy基因序列，序列长度为2582个碱基，编码680个氨基酸。
2.Bmbuffy基因的表达分析
对家蚕不同组织中Bmbuffy基因的表达情况进行测定。