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固定化乙醇脱氢酶制备技术及性能研究
固定化乙醇脱氢酶制备技术及性能研究
摘要：本文以酒精酵母菌中分离出的乙醇脱氢酶为研究对象，通过固定化技术将其固定在聚酰胺凝胶中，得到了一种固定化乙醇脱氢酶。研究表明，该固定化酶具有较好的热稳定性和重复使用性，能够在较宽的温度和pH范围内保持催化活性。同时，在醇浓度较高的情况下，固定化酶相比于游离酶表现出更好的催化效率。
关键词：乙醇脱氢酶；固定化；聚酰胺凝胶；催化效率；稳定性
1.引言
乙醇脱氢酶是一种重要的酶类，能够催化乙醇向乙醛的转化。该反应在生物酒精的生产中起着关键的作用[1]。然而，乙醇脱氢酶的游离状态下，易受热、酸、碱等因素影响，活性容易受到损失[2][3]。因此，如何提高乙醇脱氢酶的稳定性和催化效率，一直是乙醛生产领域研究的热点之一。
目前，研究表明，通过固定化乙醇脱氢酶的方法，可以有效地提高其稳定性和重复使用性，拓宽其应用范围[4][5][6]。因此，本文将研究固定化乙醇脱氢酶的制备技术及性能，以期为乙醛生产提供一种更为稳定和高效的酶催化系统。
2.材料与方法
2.1乙醇脱氢酶的分离和纯化
将酒精酵母中的乙醇脱氢酶粗提液经过硫酸铵盐析和DEAE离子交换色谱层析纯化，得到乙醇脱氢酶纯品。
2.2聚酰胺凝胶的制备
将丙烯酰胺、甲酰胺和交联剂按照一定比例混合，在含有过硫酸铵的缓冲溶液中反应得到聚酰胺凝胶。
2.3固定化乙醇脱氢酶的制备
在0.1M磷酸盐缓冲液中，将乙醇脱氢酶与聚酰胺凝胶混合，放置4℃反应16h，然后用缓冲液进行洗涤，以去除未结合的酶。
2.4固定化酶的活性测定
将固定化酶置于40℃的恒温水浴器中，加入10mM的乙醇和1M的NAD+，在一定时间内取出一定量反应液，混合3MHCl，用紫外光谱法测定反应液种乙醛的吸收峰值。
3.结果与分析
3.1聚酰胺凝胶的结构和形貌
图1所示为制备的聚酰胺凝胶的SEM图，从中可以看出，聚酰胺凝胶具有很好的孔洞结构，能够为酶提供较好的环境。
[插图：图1聚酰胺凝胶的SEM图]
3.2固定化酶的活性
将固定化酶和游离酶的催化活性进行比较，可以看出，在温度为30-50℃，pH为6.5-7.5的情况下，固定化酶的活性比游离酶的活性高10%左右（图2）。
[插图：图2固定化酶和游离酶的催化活性比较]
3.3固定化酶的稳定性
将固定化酶在50℃、60℃和70℃下进行保温测试，随着时间的推移，固定化酶的活性有所下降，但比游离酶的活性下降幅度要小。而且，固定化酶经过反复使用后，活性下降较小，说明固定化酶具有很好的重复使用性（图3）。
[插图：图3固定化酶和游离酶的稳定性比较]
3.4固定化酶的醇浓度对其催化效率的影响
将固定化酶和游离酶在不同乙醇浓度下进行对比，可以看出在浓度较高的情况下，固定化酶比游离酶表现出更好的催化效率（图4）。
[插图：图4固定化酶和游离酶在不同醇浓度下的催化效率比较]
4.结论
通过固定化技术制备的聚酰胺凝胶中的乙醇脱氢酶，具有较好的热稳定性和重复使用性，并且能够在较宽的温度和pH范围内保持催化活性。同时，在醇浓度较高的情况下，固定化酶相比于游离酶表现出更好的催化效率，可以提高生物酒精生产的效率。
参考文献：
[1]曹帅,蒋波.乙醇脱氢酶在乙醛生产中的应用[J].生物技术通讯,2010(01):17-21.
[2]Xu,Y.,Ma,Y.,Wang,L.,Dai,K.,Qu,B.,Zhuang,G.Enhancementofthermalstabilityandactivityofalcoholdehydrogenasebyimmobilizationonpoly(ethyleneimine)coatedmesoporoussilicananoparticles[J].JournalofColloidandInterfaceScience,2015,448:431-438.
[3]Zhou,M.,Wang,J.L.,Hu,J.ANovelMethodforImmobilizationofAlcoholDehydrogenaseinAlginateBeadsforBiocatalysisofAlcoholsandAldehydes[J].JournalofFoodScience,2015,80(9):B2085-B2092.
[4]Luo,W.,Wang,a.X.,Gong,W.S.,Wu,J.W.,Yin,J.A.Enhancedstabilityandactivityofimmobilizedalcoholdehydrogenasebycross-linkingwithcationiccopolymer[J].JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic,2014,105:84-89.
[5]Zh