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嗜热毛壳菌热稳定β-1，3-葡聚糖酶的基因克隆、表达及性质研究
引言
葡聚糖是一种由β-1，3和β-1，6-糖苷键连接的多糖，广泛存在于真菌和一些植物中。其中，β-1，3-葡聚糖是真菌细胞壁中重要的组成部分。同时，在生物医学工程和食品工业中，β-1，3-葡聚糖具有广泛用途。因此，研究能够高效水解β-1，3-葡聚糖的酶对于工业应用具有重要意义。本实验旨在克隆嗜热毛壳菌热稳定β-1，3-葡聚糖酶的基因，进而表达该酶，并探讨其酶学性质。
材料与方法
1.细菌菌株和质粒
嗜热毛壳菌菌株MG08-16收藏于本实验室。pET21a(+)质粒从北京生物成像平台购买。
2.培养基和制备
LB培养基用于细菌生长；Luria-Bertani低盐添加物(LB-L)用作细菌的洗涤缓冲液。E.coliBL21(DE3)是由本实验室提供。
3.克隆
嗜热毛壳菌的菌落接种于LB培养基中。在37℃下反应24小时后，菌落收集并进行基因提取。基因编码β-1，3-葡聚糖酶。PCR扩增产物与pET21a(+)载体进行酶切反应后Ligation，再将其在E.coliDH5α中转化，选用黑素素筛选正常转化细胞，并利用PCR技术进行鉴定。
4.表达
酶切鉴定通过后，将正常转化的pET21a-β-1，3-葡聚糖酶重组质粒注入E.coliBL21(DE3)中进行表达。在37℃下，对其进行诱导表达，过滤液进行最终酶学性质的研究。
5.实验设计
1)采用1%的pH5.0壳聚糖作为底物，研究酶对底物的降解能力。
2)考察不同温度下酶的活性变化：0-120℃下，将0.1mL的酶液加入1%pH5.0的壳聚糖溶液中，反应15分钟。完成反应后，加入NaOH停止反应，反应前后壳聚糖的剩余量通过DNS法进行测定。
结果
1.克隆
PCR扩增产物经酶切鉴定后，大小与预期相符合。
2.表达
利用pET21a-β-1，3-葡聚糖酶重组质粒成功表达出相应的嗜热毛壳菌热稳定β-1，3-葡聚糖酶。
3.酶学性质
1）嗜热毛壳菌热稳定β-1，3-葡聚糖酶能够高效地水解壳聚糖。
2）酶的最适工作温度范围为60-80℃，在120℃时酶活性极低。
结论
本实验成功克隆了嗜热毛壳菌热稳定β-1，3-葡聚糖酶的基因，并且表达了相应的酶。进一步探讨了酶学性质，结果表明该酶具有较高的水解活性和热稳定性，为后续工业化应用提供了有力的基础。
参考文献：
1.谢斌.β-1，3-葡聚糖酶的应用前景[J].黑龙江饲料,2009,(04):46-48.
2.成芝.嗜热毛壳菌菌株的鉴定与热稳定酶研究[D].扬州大学,2010.