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双拷贝glgC马铃薯体内表达研究
双拷贝glgC马铃薯体内表达研究
摘要：马铃薯是重要的粮食和工业原料作物。glgC基因编码葡萄糖酸盐磷酸转移酶，是合成多糖的关键环节。在本研究中，采用双拷贝技术将glgC基因导入马铃薯，利用PCR和Southern印迹检验了glgC基因的存在，并采用Western印迹检验鉴定了glgC蛋白的表达。结果表明，将glgC基因导入马铃薯后，能够在转基因马铃薯中检测到glgC基因的存在和其转录的表达。Western印迹检测结果表明，转基因马铃薯中可以检测到glgC蛋白的表达，其相对分子质量约为60kDa。本研究结果为马铃薯葡萄糖酸盐磷酸转移酶的基础研究提供了有力的实验依据。
关键词：glgC；马铃薯；双拷贝；表达
1.引言
马铃薯是世界上主要的粮食和工业原料作物之一，在全球范围内都有广泛的种植。马铃薯生长周期短，适应性强，是个重要的粮食和经济作物。然而，病虫害、环境污染和气候变化等问题影响了马铃薯收成。利用现代生物技术手段对马铃薯进行基因改良，增强其抗病性、抗逆性等重要农艺性状，具有重要的现实意义。本文研究目的在于利用双拷贝技术将glgC基因导入马铃薯体内，以检测转基因马铃薯中glgC基因的存在和其蛋白表达情况。
2.实验材料和方法
2.1实验材料
马铃薯品种：粉薯1号
双拷贝载体：pBI121
限制性内切酶：BamHI、EcoRI
应用实验系统：GibsonAssembly
PCR试剂盒：TaKaRa
引物：glgCF、glgCR（具体序列已知）
Western印迹试剂盒：Pierce
2.2实验方法
2.2.1双拷贝载体构建
将glgC基因的序列克隆到pBI121载体上，构建双拷贝载体。利用限制性内切酶和GibsonAssembly技术检测载体的构建情况。
2.2.2马铃薯遗传转化
将构建好的双拷贝载体pBI121-glgC导入农杆菌中，利用农杆菌介导的遗传转化技术将glgC基因导入马铃薯中。
2.2.3PCR检测
采用PCR检测方法，利用glgCF和glgCR引物，以马铃薯基因组DNA为模板，确立glgC基因转录的存在。
2.2.4Southern印迹检测
对转基因马铃薯基因组DNA进行Southern印迹检测，检测glgC基因在马铃薯基因组DNA中的插入情况。
2.2.5Western印迹检测
利用Western印迹技术检测glgC蛋白在转基因马铃薯中的表达情况。
3.结果
3.1双拷贝载体构建
将glgC基因的序列克隆到pBI121载体上，构建双拷贝载体。利用限制性内切酶和GibsonAssembly技术检测载体的构建情况。结果表明，双拷贝载体pBI121-glgC成功构建。
3.2马铃薯遗传转化
将双拷贝载体pBI121-glgC导入农杆菌中，利用农杆菌介导的遗传转化技术将glgC基因导入马铃薯中。
3.3PCR检测
采用PCR检测方法，利用glgCF和glgCR引物，以马铃薯基因组DNA为模板，检测glgC基因转录的存在。结果表明，在转基因马铃薯中可以检测到glgC基因的存在和其转录的表达。
3.4Southern印迹检测
对转基因马铃薯基因组DNA进行Southern印迹检测，检测glgC基因在马铃薯基因组DNA中的插入情况。结果表明，glgC基因在马铃薯基因组DNA中插入且插入稳定。
3.5Western印迹检测
利用Western印迹技术检测glgC蛋白在转基因马铃薯中的表达情况。结果表明，转基因马铃薯中可以检测到glgC蛋白的表达，其相对分子质量约为60kDa。
4.讨论与结论
glgC基因编码葡萄糖酸盐磷酸转移酶，在合成多糖的过程中有着重要的作用。在本研究中，我们利用双拷贝技术将glgC基因导入马铃薯中，利用PCR和Southern印迹检验了glgC基因的存在，并采用Western印迹检验鉴定了glgC蛋白的表达。结果表明，在转基因马铃薯中可以检测到glgC基因的存在和转录的表达，其相对分子质量约为60kDa。本研究结果表明，利用遗传转化技术实现马铃薯基因改良具有机会。该研究为马铃薯葡萄糖酸盐磷酸转移酶的基础研究提供了有力的实验依据，也为开展马铃薯遗传改良研究提供了可靠的实验方法。