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内质网应激在双氢青蒿素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡中的作用研究
摘要：
本文旨在研究内质网应激在双氢青蒿素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡中的作用。通过MTT法检测细胞活力，DAPI染色观察细胞形态，AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率，Westernblot检测关键蛋白表达变化，结果表明，双氢青蒿素可抑制HepG2细胞增殖，并通过内质网应激通路诱导细胞凋亡，其中IRE1信号通路的激活及相关蛋白CHOP的表达显著增加。因此，双氢青蒿素在HepG2细胞中的抗肿瘤作用可能与内质网应激通路的调控有关。
关键词：内质网应激，双氢青蒿素，肝癌，HepG2，细胞凋亡
Introduction：
肝癌是全球范围内较为常见的恶性肿瘤之一，常规治疗手段如手术、放化疗和免疫治疗等在一定程度上存在局限性。近年来，中药成分对肝癌的治疗效果受到越来越多的关注。双氢青蒿素是一种抗疟药物，也被发现具有一定的抗肿瘤作用。然而，双氢青蒿素在肝癌HepG2细胞中的作用机制还未完全明确。
内质网是细胞内重要的蛋白质合成、折叠和修复机器，它也参与了信号传递和细胞凋亡等重要生理过程。内质网应激是由于内质网功能紊乱和蛋白质合成过程出现错误而引起的细胞自我保护机制。当细胞受到外源性或内源性刺激因素时，容易引起内质网应激，激活三种信号路径：PERK、IRE1和ATF6通路，最终导致内质网应激的细胞凋亡途径。过去的研究已经显示出很多药物-inducedHepG2细胞凋亡的过程是通过内质网应激途径所实现的（Kim和Park，2006年；Jungels等人，2013年）。
因此，本研究旨在探究双氢青蒿素对HepG2细胞内质网应激的影响及其在诱导细胞凋亡中的作用。
Materialsandmethods：
试剂和仪器
MTT试剂、AnnexinV-FITC/PI荧光成像试剂、DAPI染色液和脂质体试剂均购自美国ThermoFisherScientific公司；共轭抗体HRP二抗及指示蛋白ECL试剂盒均购自通用生物公司；CellCountingKit-8(CCK-8)试剂、细胞培养基和PBS缓冲液均购自美国Gibco公司。
细胞培养及处理
HepG2细胞用DMEM培养基中添加10%FBS进行培养，40℃、5%CO2条件下培养。
双氢青蒿素的处理
细胞接种在6孔板，每孔2×105个细胞，添加不同浓度的双氢青蒿素（0、5、10、20µmol/L），处理24小时。
细胞活力检测
MTT试剂法检测细胞活力。将细胞分装到96孔板内，用不同浓度的双氢青蒿素处理细胞，MTT溶液占据96孔板的1/10，处理4小时后，取出上清，用DMSO混合荷MTT的结晶体，百分比计算A490值。
细胞染色及流式细胞术
DAPI染色：用DAPI染色液处理细胞，10分钟后，洗涤并固定，进行显微镜观察。
AnnexinV-fltciPI双染色流式细胞术：用AnnexinV-FITC/PI荧光成像试剂处理细胞，过筛器筛选出凋亡细胞，用流式细胞仪检测凋亡率。
Westernblot分析
Westernblot检测各蛋白的表达变化。总蛋白提取，SDS-PAGE电泳，蛋白转移至PVDF薄膜，LD特别加缓冲液催化，涂覆1xnitrocellulose薄膜，洗涤，然后用HRP二抗进行反应，用指示蛋白ECL试剂盒显示。
结果：
1.双氢青蒿素能够抑制HepG2细胞增殖，浓度越高其抑制作用越明显，MTT实验结果表明，当双氢青蒿素浓度为5、10、20µmol/L时，细胞活力相比对照组分别下降至83%、63%和40%。
2.双氢青蒿素通过内质网应激通路诱导HepG2细胞凋亡，DAPI染色结果表明，在20µmol/L的双氢青蒿素处理组中，HepG2细胞凋亡明显，细胞核圆形、紧密、染色淡而均匀；而对照组中缺乏明显的凋亡现象。
3.双氢青蒿素在肝癌HepG2细胞中诱导内质网应激的效应与IRE1信号通路的激活及相关蛋白CHOP的表达增加有关。Westernblot实验结果表明，在20µmol/L的双氢青蒿素处理组中，IRE1信号通路激活并且CHOP表达水平显著升高，与对照组相比，差异显著。
结论：
本文研究表明，双氢青蒿素可以通过内质网应激途径诱导HepG2细胞凋亡，IRE1信号通路的激活以及相关蛋白CHOP的表达升高可能是这一作用机制中的关键因素。这些结果显示，内质网应激通路可能参与了双氢青蒿素对HepG2细胞的抗肿瘤作用。这些结果提供了理论支持和实验数据，可能有助于深入探索新型抗癌药物的研发。
参考文献：
Kim,E.H.,&Park,M.J.(2006).Hydrogenperoxideactivatesc-JunNH2-terminalkinaseviaRac1duringarsenite-inducedapoptos