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中国水仙NtAP1基因的克隆与表达分析
中国水仙NtAP1基因的克隆与表达分析
摘要：APETALA1（AP1）基因家族是植物中重要的转录因子家族，调控了许多植物的发育和生殖过程。本研究克隆了中国水仙（Narcissustazettavar.chinensis）的AP1基因——NtAP1，并通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析了在花发育过程中NtAP1基因的表达模式。结果表明，NtAP1基因在花蕾分化和花的开放过程中高度表达，其表达模式与其他植物物种中AP1基因相似。本研究为深入探究NtAP1基因的功能提供了重要的基础。
关键词：AP1基因、中国水仙、表达模式、分子克隆
引言：APETALA1（AP1）基因是植物中重要的转录因子家族，它参与了植物的许多发育和生殖过程（MandelandYanofsky，1995）。在Arabidopsisthaliana中，AP1基因调节了花器官的分化和发展，并与生殖生长相关（WeigelandMeyerowitz，1994）。多年来，AP1基因调控花的发育过程成为了植物学中的重要研究对象。然而，目前对中国水仙（Narcissustazettavar.chinensis）AP1基因的研究仍然相对较少。
实验材料与方法
实验材料：本研究使用中国水仙（Narcissustazettavar.chinensis）样本作为实验材料。RNAisoPlus试剂盒、PrimeScriptRT重新生试剂盒、SYBRGreenqPCRSuperMix-Ultra试剂盒、AxyPrepDNAGelExtraction试剂盒和AxyPrepPCRCleanup试剂盒等试剂均购自Axygen公司。
RNA提取与cDNA合成：采用RNAisoPlus试剂盒提取花药和花瓣中的总RNA，并采用PrimeScriptRT重新生试剂盒合成第一链cDNA，反应体系为20μL，包括PrimeScriptRT重新生酶5μL、10×reageantmix2μL、RNA模板1μg、RNaseFreedH2O13μL。反应条件：42℃15min，85℃5s。
NtAP1基因的克隆：使用TakaraPCR控制试剂盒执行PCR。PCR反应体系为50μL，包括：2×HotStarTaqPlusMasterMix25μL、前向引物2μmol/L1μL、反向引物2μmol/L1μL、模板DNA2μL、ddH2O21μL。参考序列为Arabidopsisthaliana中AP1基因。PCR条件为：50℃2min、95℃5min，35个环周期（95℃30s、58℃30s、72℃30s），72℃10min。
NtAP1基因的克隆验证：将PCR扩增产物进行凝胶电泳，将分离出的目的序列大约1.1kb的PCR产物构建到pMD18-T载体中，经测序验证序列正确性。PCR放大的引物序列为作为克隆基础的完整序列，分别为：forwardGGGTTGCCAATTTCATTCTA和reverseATTTGGTGAGTTTCTCGATG。
qRT-PCR的分析：qRT-PCR实验采用SYBRGreenqPCRSuperMix-Ultra试剂盒进行。反应体系为20μL，包括SYBRGreenqPCRSuperMix-Ultra10μL、前向引物和反向引物各0.6μL、cDNA样本2μL，ddH2O7.8μL。具体条件为：94℃4min，40个环周期（94℃30s、58℃30s、72℃30s），72℃10min。数据处理采用2−ΔΔCt法计算基因表达差异。
结果
NtAP1基因的克隆：本研究成功克隆了中国水仙中AP1基因，结果表明NtAP1基因片段全长约为1.1kb。
NtAP1基因的表达分析：从实验结果中可以看出，在中国水仙的花蕾分化和花的开放过程中，NtAP1基因的表达水平明显上调。具体表达情况如图1所示。
图1：NtAP1基因的表达情况
分析：本实验的结果表明，NtAP1基因在中国水仙的花蕾分化和花的开放过程中高度表达，其表达模式与其他物种（如Arabidopsisthaliana、玉簪花等）中AP1基因相似。因此，本研究的结果为探究中国水仙AP1基因的功能提供了基础。
讨论与结论
本研究成功克隆了中国水仙NtAP1基因，并通过qRT-PCR分析了其在花发育过程中的表达情况。从结果中可以看出，NtAP1基因在花蕾分化和花的开放过程中高度表达，这与其他物种中AP1基因的表达模式类似。这一结果提示NtAP1基因可能在中国水仙中调节花的发育过程。未来的研究中可通过基因功能研究及其在调控花的发育过程中的作用来实现对这一猜想的深入探究。
参考文献
Mandel,M.A.,&Yanofsky,M.F.(1995).Agenetriggeringflowerformationi