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丹参素对肝星状细胞RhoARockⅠ信号通路影响的研究
摘要：
丹参素（TanshinoneI）是一种从丹参中提取出来的天然化合物，具有多种药理作用。本研究旨在探讨丹参素对肝星状细胞RhoA/RockⅠ信号通路的影响。研究结果表明，丹参素能够抑制HSC-T6细胞中RhoA和RockⅠ的表达，同时降低细胞凋亡率，增强细胞活力。通过Westernblot和RT-PCR等实验手段研究发现，丹参素在HSC-T6细胞中通过抑制TGF-β1诱导的Smad信号通路抑制RhoA/RockⅠ信号通路。该研究表明，丹参素可能通过特定的信号通路影响肝星状细胞的生理和病理过程，从而具有潜在的治疗肝病的作用。
关键词：丹参素；肝星状细胞；RhoA/RockⅠ信号通路；TGF-β1信号通路
正文：
Ⅰ.引言
肝病是一组疾病的统称，包括肝硬化、肝癌、肝炎等。随着现代化生活方式的普及，肝病的患病率不断上升，成为当前严重的公共卫生问题。肝星状细胞（Hepaticstellatecells，HSCs）是肝脏的关键细胞之一，也是肝星状细胞增生的主要来源。肝星状细胞增生是肝纤维化和肝硬化的主要发病机制之一，因此抑制肝星状细胞的增生对于预防和治疗肝病具有重要的意义。
RhoA/RockⅠ信号通路在肝星状细胞增生和肝纤维化等病理过程中起着重要作用。该信号通路通过肌动蛋白骨架的重组和细胞内基质的分泌等机制参与了肝纤维化的产生和发展。因此，研究肝星状细胞的RhoA/RockⅠ信号通路对于解决肝病的治疗问题具有重要的意义。
丹参素（TanshinoneI）是一种天然化合物，是从丹参属植物根茎中提取出来的主要成分之一，具有多种药理作用。近年来，丹参素受到了广泛关注，其具有抗肿瘤、抗炎等多种作用，已被广泛应用于临床治疗。然而，关于丹参素对肝星状细胞RhoA/RockⅠ信号通路的影响研究还很少，本文旨在探讨丹参素对肝星状细胞RhoA/RockⅠ信号通路的影响及其机制。
Ⅱ.材料与方法
1.实验材料
HSC-T6细胞系，30μmol/L丹参素，10μg/mlTGF-β1，TRIzol，M-MLV逆转录酶，SYBRGreenI，荧光定量PCR，Westernblot。
2.细胞培养
HSC-T6细胞在DMEM、10%FBS、100U/ml乳酸菌素和100μg/ml青霉素/链霉素的条件下培养，完全接触立体培养。当细胞生长至60%到70%时，加入30μmol/L丹参素和10μg/mlTGF-β1进行刺激处理，持续处理48h。
3.细胞增殖实验
采用MTT法检测HSC-T6细胞的增殖能力。细胞在24孔板中接种，每孔10000个细胞。细胞接种后48小时后，加入30μmol/L丹参素和10μg/mlTGF-β1进行刺激处理，细胞进一步培养24小时后，加入5mg/ml的MTT，再保护30min后，细胞摇晃至MTT完全溶解。使用ELISA读板机测量每个孔中的OD值。实验进行三次，每次需要做三个重复的孔。
4.Westernblot实验
将提取的蛋白质用10%SDS-PAGE进行分离，然后转移到PVDF膜上。膜孔中加入5%的奶粉基础流体，经过1小时的阻塞。在膜上加入RhoA、ROCKⅠ和GAPDH的主要抗体，同时使用防兔或防小鼠的次级抗体标记抗体。通过ECL的显色来观察膜上蛋白的表现。
5.Real-timePCR实验
将HSC-T6细胞收集，并根据实验所需抽取RNA。根据RNA的浓度将其转录为cDNA。使用SYBRGreenI方法对其进行实时PCR。实验过程中自主设计cDNA引物，有无模板和模板存在与否之间的实验对照。最终的结果通过相对定量法进行分析。
Ⅲ.结果
1.丹参素对HSC-T6细胞的生长和增殖的影响
MTT实验证明，在丹参素的加入下，HSC-T6细胞的增殖能力显著降低，而TGF-β1的加入可以诱导HSC-T6细胞的增殖。同时，当TGF-β1和丹参素一起加入时，能部分逆转TGF-β1的刺激作用。
2.丹参素对HSC-T6细胞的凋亡的影响
流式细胞术表明，丹参素能够显著降低HSC-T6细胞的凋亡率，同时抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞凋亡作用。
3.丹参素对HSC-T6细胞RhoA/RockⅠ信号通路的影响
Westernblot实验证实，丹参素能够抑制HSC-T6细胞RhoA和RockⅠ的表达，同时降低Smad3的表达。Real-timePCR实验也表明，丹参素能够通过特定的信号通路抑制TGF-β1诱导的Smad信号通路，从而抑制RhoA/RockⅠ信号通路。
Ⅳ.讨论
本研究旨在探讨丹参素对肝星状细胞RhoA/RockⅠ信号通路的影响及其机制。通过MTT实验验证，丹参素能够抑制HSC-T6细胞的增殖能力。此外，丹参素还能够显著降低HSC-T6细胞的凋亡率，同时抑制TGF-β1诱导的H