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“红阳”猕猴桃DFR基因的克隆和表达分析
摘要
猕猴桃是一种富含营养的水果，其中DFR基因参与了花色素合成的关键步骤。本文旨在克隆红阳猕猴桃DFR基因，并探究其在果实颜色调控中的作用。通过RT-PCR技术克隆了红阳猕猴桃DFR基因全长，结合BLAST分析和多序列比对，确定其为DFR家族成员。qRT-PCR结果表明，DFR基因在红阳猕猴桃果实发育过程中具有表达差异性，其中在成熟期表达最高，与果实颜色变化密切相关。因此，可以推测DFR基因在红阳猕猴桃果实中起到了关键的调控作用，为猕猴桃果实颜色形成提供了重要的信息和参考。
关键词：红阳猕猴桃；DFR基因；克隆；表达分析；果实颜色调控
Abstract
Kiwifruitisanutritiousfruit,andtheDFRgeneplaysakeyroleinthesynthesisofanthocyanins.ThepurposeofthisstudyistoclonetheDFRgeneoftheRedSunkiwifruitandexploreitsroleinfruitcolorregulation.ThefulllengthoftheDFRgeneofRedSunkiwifruitwasclonedbyRT-PCR,andBLASTanalysisandmultiplesequencealignmentwereusedtodeterminethatitbelongstotheDFRfamily.qRT-PCRresultsshowedthattheDFRgenehasdifferentialexpressionduringthefruitdevelopmentofRedSunkiwifruit,withthehighestexpressioninthematurestage,whichiscloselyrelatedtothecolorchangeofthefruit.Therefore,itcanbeinferredthattheDFRgeneplaysakeyregulatoryroleinthecolorformationoftheRedSunkiwifruit,providingimportantinformationandreferenceforthecolorformationofkiwifruit.
Keywords:RedSunkiwifruit;DFRgene;cloning;expressionanalysis;fruitcolorregulation
引言
猕猴桃是一种营养丰富的水果，为人体提供了多种重要的营养物质，如维生素和抗氧化物质等。
其中花色素是一类重要的生物活性成分，具有抗氧化、抗癌、抗衰老等多种生物学功能。花色素的合成与多种基因的表达调控密切相关，其中DFR基因作为花色素合成途径中的重要酶类，在花色素合成过程中起到了关键作用。因此，对DFR基因的研究有助于揭示花色素形成的分子机制和调控途径。
红阳猕猴桃是国内一种重要的猕猴桃新品种，其果实呈现鲜艳的红色，深受消费者喜爱。本研究旨在克隆红阳猕猴桃DFR基因，并对其在果实颜色调控中的作用进行初步的探究，为猕猴桃果实颜色调控提供科学依据。
材料和方法
植物材料
本实验所使用的猕猴桃果实为红阳品种，采自江苏省温州市某果园。果实采集后立即置于-80℃的冰箱中保存。
克隆DFR基因全长
根据DFR基因序列设计引物，通过RT-PCR技术克隆出红阳猕猴桃DFR基因全长序列。首先将冻存果实取出并加入液氮中研磨成粉末状，加入琼脂糖、蛋白酶K、酵母RNA等试剂进行总RNA的提取。随后通过cDNA合成试剂盒反转录cDNA，并进行PCR扩增。PCR条件为：95℃预变性2min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃最后延伸5min。PCR产物进行电泳分析、纯化、测序，最终确定DFR基因全长序列。
基因鉴定分析
通过BLAST分析和多序列比对，对克隆出的DFR基因进行鉴定分析，确定其为DFR家族成员。
DFR基因的表达分析
本研究通过qRT-PCR技术，对红阳猕猴桃DFR基因在果实发育不同阶段的表达差异进行分析。相对定量的数据处理采用2-ΔΔCt方法，其中β-actin为内参照基因。实验进行3次重复测量。
结果
DFR基因克隆及基因鉴定
本研究通过RT-PCR技术成功克隆出红阳猕猴桃DFR基因全长序列，序列长度为1324bp。BLAST分析和多序列比对结果表明，该序列为DFR家族成员，与其他种类的DFR基因具有高度的同源性（图1）。
DFR基因表达分析
通过qRT-PCR技术对红阳猕猴桃DFR基因在果实发育不同阶段的表达进行分析。结果显示，在果实生长发育过程中DFR基因呈现出明