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不同浓度的bFGF和EGF对体外培养的视网膜色素上皮细胞增殖的影响
引言
视网膜色素上皮细胞（retinalpigmentepitheliumcells,RPE）是视网膜中最重要的细胞之一，对维持视网膜结构和视觉功能非常关键。RPE细胞是由神经外胚层发育，具有多种重要的生物学功能，如吸收光线、光化学反应、营养物质输送等等。RPE细胞的异常或损伤会导致多种眼病的发生，如黄斑变性、继发性白内障等等。
基质细胞源性生长因子（stemcellfactor,SCF）、基本成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）和表皮生长因子（epidermalgrowthfactor,EGF）被广泛应用于细胞培养和组织工程的研究中。SCF、bFGF和EGF能够促进细胞增殖、细胞迁移和组织再生等过程。在视网膜色素上皮细胞的培养中，以bFGF和EGF为代表的生长因子可有效促进RPE细胞增殖。但是，不同浓度的bFGF和EGF对视网膜色素上皮细胞增殖的影响仍存在差异。因此，本研究旨在探究不同浓度的bFGF和EGF对体外培养的视网膜色素上皮细胞增殖的影响，并深入探究两种生长因子对RPE细胞增殖的作用机制。
材料与方法
细胞培养
本实验采用的是体外细胞培养技术，采集视网膜组织，经消化酶消化，再经过细胞筛进行过滤。将RPE细胞取出培养，添加10%胎牛血清，存放在37℃和5%CO2培养条件下。分别设置bFGF和EGF两组实验，设立3个浓度梯度，每个梯度设6个样本，总共进行36组实验。不同浓度的bFGF和EGF经过顺序稀释，分别添加到培养基中，设立组为空白对照组。
细胞增殖实验
为了研究不同浓度的bFGF和EGF对RPE细胞的影响，应用体内细胞增殖实验方法。在每个组实验中，测定不同时间点下细胞增殖情况，采用MTT法（3-(4,5-二甲硫安酰基)-2,5-二苯基四唑）进行检测。
细胞凋亡实验
为了研究不同浓度的bFGF和EGF对RPE细胞凋亡的影响，应用体内细胞凋亡实验方法。在每个组实验中，测定不同时间点下细胞凋亡情况，采用AnnexinV/PI染色法进行检测。
Westernblot分析
为了探究不同浓度的bFGF和EGF对细胞增殖的作用机制，采用Westernblot方法测定细胞中细胞周期相关蛋白（CyclinD1、CyclinE、CDK2、p21、p27）的表达情况。
结果
不同浓度的bFGF和EGF对RPE细胞增殖的影响
实验结果显示，与空白对照组相比，bFGF和EGF在不同浓度下均能够促进RPE细胞的增殖，但是其作用效果存在差异。以bFGF为例，当浓度为10ng/ml时，其能够明显促进RPE细胞增殖，当浓度超过20ng/ml时，增殖效应逐渐减弱甚至趋于饱和。以EGF为例，当浓度为10ng/ml时，其能够明显促进RPE细胞增殖，但当浓度超过20ng/ml时，促进作用减弱明显，甚至使得细胞数量出现负增长。
不同浓度的bFGF和EGF对RPE细胞凋亡的影响
实验结果显示，与空白对照组相比，bFGF和EGF在不同浓度下均不能明显影响RPE细胞的凋亡。无论是浓度较低的10ng/ml，还是浓度较高的40ng/ml，两种生长因子对RPE细胞凋亡的影响均不显著。
不同浓度的bFGF和EGF对细胞周期相关蛋白的表达情况的影响
实验结果显示，bFGF和EGF均能够显著增加RPE细胞中CyclinD1、CyclinE和CDK2的表达，而p21、p27的表达则下降。当浓度达到一定值后，这种影响趋于饱和。此外，bFGF和EGF的增殖作用可能通过细胞周期相关蛋白的影响产生.
讨论
本实验的结果显示，不同浓度的bFGF和EGF对视网膜色素上皮细胞增殖的影响存在差异，而两种生长因子对RPE细胞的凋亡几乎没有影响。这与之前的相关研究结果一致。多项研究表明，在视网膜色素上皮细胞的培养中，以bFGF和EGF为代表的生长因子可有效促进RPE细胞增殖。此外，前期研究表明bFGF对RPE细胞的增殖作用主要是通过启动细胞周期相关蛋白的表达，进而促进细胞进入增殖期，从而促进RPE细胞增殖。我们的实验结果对此也进行了数据支撑，即bFGF和EGF的增殖作用可能通过细胞周期相关蛋白的影响产生。
在本实验中，bFGF和EGF的增殖作用会随着生长因子浓度的变化而出现不同的影响。我们的结果显示，当浓度为10ng/ml时，bFGF和EGF能够明显促进RPE细胞增殖，当浓度超过20ng/ml时，增殖效应逐渐降低。这可能是由于当浓度达到一定水平后，生长因子的受体数量趋于饱和，细胞内信号传导途径的调节也随之出现反应饱和。这个结果提示了，在实践应用过程中，应该根据具体情况选择合适的生长因子浓度，科学指导细胞增殖和治疗的进程。
结论
本实验的研究结果表明，以bFGF和EGF为代表的生长因