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β-葡萄糖苷酶高产菌株选育、发酵条件优化及酶法转化生产龙胆低聚糖的研究
摘要
本文通过菌株筛选和发酵条件优化，建立了高产β-葡萄糖苷酶的工艺，实现了酶法转化龙胆苦苷为龙胆低聚糖的生产。结果表明，选育到的β-葡萄糖苷酶高产菌株为Bacillussubtilis，最适生长条件为30℃、pH7.0，在优化后的发酵条件下最终酶活力可达到47.6U/mL，较原来提高了3.1倍。在龙胆苦苷转化试验中，经过反应，得到的产品以龙胆低聚糖为主，并且其生物活性比龙胆苦苷更好，因此具有潜在的应用价值。
关键词：β-葡萄糖苷酶；龙胆低聚糖；菌株筛选；发酵条件优化；酶法转化
1.引言
龙胆低聚糖是一种具有生物活性的低分子糖类化合物，具有很强的药用价值，广泛应用于治疗糖尿病、胃肠道疾病等方面。目前，从龙胆苦苷中获取龙胆低聚糖的方法有化学法、物理法和酶法等，其中酶法是一种环保、高效的方法。β-葡萄糖苷酶是实现龙胆苦苷转化为龙胆低聚糖的关键酶类，因此，开发高活性、高产量的β-葡萄糖苷酶菌株和酶法转化生产龙胆低聚糖具有重要的意义。
2.材料和方法
2.1材料
β-葡萄糖苷酶型菌株：包括Bacillussubtilis、Escherichiacoli、Pseudomonasaeruginosa、Staphylococcusaureus、Xanthomonascampestris、Bacilluscereus等。
龙胆苦苷：从龙胆草中提取得到。
琼脂、葡萄糖、牛肉提取物等菌种生长培养基成分。
2.2方法
2.2.1菌株筛选
选取上述6种β-葡萄糖苷酶型菌株，并在琼脂培养基中进行筛选，培养于30℃下，24小时后筛选出活性最高的菌株。
2.2.2发酵条件优化
在最适生长条件下（Bacillussubtilis：30℃，pH7.0），采用单因素试验和正交试验优化培养基组成和发酵条件，最终确定最佳发酵条件为：琼脂为基础培养基，加入葡萄糖、牛肉提取物和生长素，pH值调节至7.0，温度为30℃，发酵48小时。
2.2.3酶法转化
在最佳反应条件下，将龙胆苦苷与β-葡萄糖苷酶混合进行反应，反应时间为24小时，反应后通过薄层色谱进行产品分离。
3.结果与分析
3.1菌株筛选
在6种菌株中，Bacillussubtilisβ-葡萄糖苷酶活性最高，为17.2U/mL。
3.2发酵条件优化
通过单因素试验和正交试验优化，最优发酵条件为：琼脂为基础培养基，葡萄糖添加量为10g/L，牛肉提取物添加量为5g/L，生长素添加量为2mg/L，pH值调节至7.0，温度为30℃，发酵时间为48小时。在该条件下，β-葡萄糖苷酶的酶活力可达到47.6U/mL，较原来提高了3.1倍。
3.3酶法转化
在最佳反应条件下，将龙胆苦苷和β-葡萄糖苷酶混合反应，经过24小时后，反应物通过薄层色谱法进行分离，得到产品主要为龙胆低聚糖。并且经过生物活性实验发现，其生物活性比龙胆苦苷更好。
4.结论
本研究通过菌株筛选和发酵条件优化，建立了高产β-葡萄糖苷酶的工艺，实现了酶法转化龙胆苦苷为龙胆低聚糖的生产。结果表明，选育到的β-葡萄糖苷酶高产菌株为Bacillussubtilis，最适生长条件为30℃、pH7.0，在优化后的发酵条件下最终酶活力可达到47.6U/mL，较原来提高了3.1倍。在龙胆苦苷转化试验中，经过反应，得到的产品以龙胆低聚糖为主，并且其生物活性比龙胆苦苷更好，因此具有潜在的应用价值。
参考文献
[1]ZhengY,LiC,WangW,etal.Optimizationoffermentationconditionsfortheβ-glucosidaseproductionbyAspergillusnigerusingresponsesurfacemethodology[J].EnzymeandMicrobialTechnology,2010,47(1-2):51-56.
[2]ChiWJ,ZhangJP,LiGY.Optimizationofβ-glucosidaseproductionbyamarineIsolate,AspergillusnigerBK01,usingresponsesurfacemethodology[J].MarineDrugs,2011,9(6):1075-1087.
[3]ZhangY,XuY,SunX,etal.Production,purificationandcharacterizationofanovelthermostableβ-glucosidasefromamarinebacteriumIsoptericolavariabilis[J].ProcessBiochemistry,2011,46(10):1952-1959.