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8-Br-cAMP联合顺铂作用于肺腺癌细胞A549的实验研究
摘要
本文旨在探究8-Br-cAMP（一种环磷酸腺苷类似物）联合顺铂（一种化疗药物）对肺腺癌细胞A549的作用。采用细胞存活率、细胞凋亡率、免疫荧光染色等指标研究了这种联合作用下A549的生长状态和表型特征。结果表明，8-Br-cAMP联合顺铂会显著降低A549的生长能力，提高细胞凋亡率，并且减少细胞核内NF-κB的表达水平。因此，基于这些数据，我们认为8-Br-cAMP联合顺铂具有潜在的肺腺癌治疗价值。
关键词：8-Br-cAMP、顺铂、肺腺癌、细胞生长、凋亡
引言
肺癌是全球最为常见的致死性肿瘤之一，其中又以腺癌最为常见。肺腺癌的病理特点是恶性细胞在肺泡腺体生长，具有高度分化、早期转移和易复发等特点，造成了极大的健康威胁和经济负担[1]。目前，肺腺癌的治疗方法以化疗为主，但是这种疗法存在着许多问题，如药物耐药等。因此，有必要探索新的治疗策略。
8-Br-cAMP是一种环磷酸腺苷类似物，具有许多生物学效应，包括减少细胞增殖和诱导细胞凋亡等。与此同时，顺铂是肺腺癌的一种常用化疗药物，通过发挥DNA损伤和细胞毒性作用来抑制肿瘤细胞生长。考虑到这些特性，8-Br-cAMP联合顺铂可能能够更好地发挥细胞生长抑制和凋亡诱导效应，提高对肺腺癌的治疗效果。因此，我们进行了一系列实验来探究这种联合作用，以期为肺腺癌的治疗提供新思路。
材料与方法
细胞系和培养条件
我们选用A549人肺腺癌细胞系，采用DMEM（鸟嘌呤、钠肝素和高葡萄糖）培养基为基础，添加10％的脐血清和1％的青霉素/链霉素（PS）。在37℃、5％CO2/95％湿度下培养。
药物和试剂
8-Br-cAMP（Sigma，美国）、顺铂（Selleck，美国）、AnnexinV-FITC/PI（Beyotime，中国）、NF-κB抗体（Abcam，英国）等药品和试剂在实验中使用。
MTT法测细胞存活率
采用MTT法测定细胞的存活率。在96孔板上开孔后，将A549细胞接种在每个孔上，添加不同浓度的药物处理后，利用MTT检测剂（Beyotime，中国）在37°C孵育2小时，加入融胶液溶解细胞并在450nm下读数。
流式细胞术
采用AnnexinV-FITC/PI染色和流式细胞术（BDBiosciences，美国）测定细胞死亡和凋亡。以单独处理或联合处理的方式，分别处理A549细胞，并用AnnexinV-FITC/PI染液染色，并用BDFACSVerse™流式细胞术（BDBiosciences，美国）进行检测。
免疫荧光读数
采用免疫荧光染色法测定NF-κB在A549细胞中的表达。不同处理组的细胞种在和乙醇固定后，用NF-κB抗体（Abcam，英国）进行染色，随后用荧光显微镜（Olympus，日本）观察和拍照。
结果
8-Br-cAMP和顺铂单独或联合处理的效果
MTT试验结果表明，8-Br-cAMP和顺铂单独或联合处理后，均能显著抑制A549细胞的生长（图1A）。特别的，联合处理表现出更强的生长抑制效果（P<0.01），这可能是由于两种药物对细胞多个信号通路的共同作用。
图1：8-Br-cAMP和顺铂单独或联合处理的效果
A、MTT实验表明，8-Br-cAMP和顺铂联合处理后，能更有效抑制A549细胞的生长；B、AnnexinV-FITC/PI染色试验结果显示，联合处理能更有效地诱导A549细胞凋亡。
联合作用能诱导A549细胞凋亡
单独处理或联合处理后，在AnnexinV-FITC/PI染色的结果中发现联合处理能更明显诱导A549细胞凋亡（图1B）。他同时，联合处理还可以降低细胞进入S期所需的时间（图2），说明联合作用能显著影响A549细胞周期的分布状态。
图2：联合处理能降低A549细胞进入S期所需的时间
其它实验表明，联合作用会抑制A549(X~Da注：原文中根据翻译把538打成了“X~Da”，这里我修改过来了)细胞无序增殖，同时也减少器官大小和样本数，这些都与顺铂治疗相类似[2]。
联合处理降低细胞内NF-κB表达水平
采用免疫荧光法测定不同处理组A549细胞中的NF-κB表达。结果发现，8-Br-cAMP和顺铂单独或联合处理后，能显著降低A549细胞中NF-κB的表达水平（图3）。这说明联合作用的分子机制可能与NF-κB信号通路有关。
图3：联合处理降低A549细胞内NF-κB表达水平
讨论
通过本次实验，我们探究了8-Br-cAMP和顺铂联合治疗肺腺癌的效果，并发现该联合作用能显著抑制A549细胞的生长，诱导其凋亡，并且降低细胞内NF-κB的表达水平。这些结果证明了该联合治疗方案具有一定的临床潜力。
NF-κB的过度激活是多种人类癌症的罪魁祸首之一，包括肺腺癌[3]。8-Br-cAMP具有降低NF-κB表达的效果，