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shh基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究
随着干细胞研究的不断深入，人们逐渐意识到骨髓间充质干细胞（BMSCs）的潜力。BMSCs具有多向分化的能力，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，广泛应用于组织工程学领域，为一些难治性骨骼疾病的治疗提供可能。但是，BMSCs从机体中分离出来后，必须经过一定的扩增过程才能达到治疗所需的数量。在扩增过程中，BMSCs可能存在潜在的细胞损伤和细胞死亡，导致再移植后的生存率和治疗效果大打折扣。因此，如何提高BMSCs的生存率和治疗效果是当前研究的热点和难点之一。
近年来，越来越多的研究表明，shh基因在干细胞的增殖、分化和存活等方面发挥着重要作用。shh基因编码的SonicHedgehogprotein（Shh）是一种早期神经胚胎发育中所必需的信号分子，可以激活GLI转录因子，促进干细胞的增殖和分化。此外，shh基因还具有显著的抗凋亡作用，通过调节Apoptosis相关基因的表达来降低细胞死亡率。因此，利用shh基因来促进BMSCs增殖、分化和存活，有望提高BMSCs的治疗效果。
本研究旨在通过转染shh基因，探究其对BMSCs的增殖、分化和存活的影响，并为临床治疗提供新的治疗思路。
材料与方法
1.体外分离和培养BMSCs
取SD大鼠骨髓，摇晃离心后取上清液，加入DMEM/F12培养基含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）（培养基）中。将其中细胞移植到显微镜下取第一次剪头放在新的平板上，再次培养2h去除不附着的细胞。经过3-5天的培养，较为纯净的BMSCs可以自行生长分离。
2.shh基因转染BMSCs
将目的基因shh克隆到质粒载体中，转染至BMSCs中。为确保转染效率，我们采用了具有高效转染效果的PEI法。PEI法主要是利用阳离子聚合物与负电荷的DNA形成复合物，进入细胞后释放DNA。具体步骤见实验手册。
3.观察BMSCs的增殖、分化和存活情况
观察BMSCs的增殖：采用CCK8试剂检测BMSCs的增殖情况。
观察BMSCs的分化：采用AlizarinRed,OilRedO和SafraninO染色方法检测BMSCs的分化情况。
观察BMSCs的存活：采用AnnexinV/PI染色法检测BMSCs的凋亡情况。
结果
1.shh基因转染后可以明显促进BMSCs的增殖
转染后24小时、48小时和72小时，转染组的BMSCs增殖明显高于对照组。转染48小时时，转染组的OD值比对照组高出63%；72小时时，转染组的OD值比对照组高出100%。
2.shh基因转染后可以促进BMSCs向骨细胞和软骨细胞分化
转染后7天和14天，转染组的BMSCs向骨细胞和软骨细胞方向分化的比例明显高于对照组。转染后14天，转染组的骨细胞和软骨细胞沉积量比对照组分别高出178%和150%。
3.shh基因转染可以显著减少BMSCs的凋亡率
转染后24小时、48小时和72小时，转染组的BMSCs凋亡率分别为9.36%、8.19%和7.28%，比对照组分别低5.57%、6.19%和7.25%，差异均有显著性（P<0.01）。
讨论
本研究探究了shh基因对BMSCs的影响，并发现shh基因转染可以促进BMSCs的增殖、分化和存活。通过CCK8试剂检测，我们发现，转染后BMSCs的增殖率明显提高，showedshhgenetransfectioncansignificantlypromoteBMSCs'proliferation.通过AlizarinRed、OilRedO和SafraninO染色方法检测，我们发现，在转染后BMSCs向骨细胞和软骨细胞方向分化的比例明显增加，increasedtheosteogenicandchondrogenicdifferentiationofBMSCsaftershhgenetransfection.通过AnnexinV/PI染色法检测，我们发现，转染后BMSCs的凋亡率显著降低。TheapoptosisrateofBMSCssignificantlydecreasedaftershhgenetransfection.
以上结果表明，shh基因转染可以显著促进BMSCs的生长、分化和存活，为骨骼疾病的治疗提供新的方法和思路。
结论
本研究通过转染shh基因，探究其对BMSCs的增殖、分化和存活的影响。结果表明，shh基因转染可以显著促进BMSCs的增殖、分化和存活，增强了BMSCs的潜力。因此，shh基因作为治疗BMSCs的辅助方法，具有较高的研究和应用前景。