鸡白细胞介素18双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用.docx

鸡白细胞介素18双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用
鸡白细胞介素18双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用
摘要：本研究旨在建立一种鸡白细胞介素18（IL-18）双抗体夹心ELISA检测方法，并初步应用于不同组织和细胞培养物中的IL-18含量测定。该方法以兔抗鸡IL-18多克隆抗体为捕获抗体，鼠抗鸡IL-18多克隆抗体为检测抗体，碱性磷酸酶标记抗鼠IgG作为二抗，碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液（pH=9.6）作为底物，以及硫酸（2M）作为终止溶液。此方法优点为快速、灵敏、方便和可重复性高。初步应用结果表明，此方法可用于血清、淋巴组织和细胞培养物中IL-18浓度的测定。
关键词：鸡；白细胞介素18；夹心ELISA；检测方法
引言
鸡白细胞介素18（IL-18）是一种细胞因子，游离的IL-18可通过作用于特定的细胞表面受体而调节细胞免疫功能或激活T细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞。因此，IL-18被广泛研究，并用于疾病诊断和治疗。目前，IL-18检测方法主要有酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白质芯片技术和流式细胞术等。其中，ELISA作为最常用的方法之一，在疾病诊断、免疫学研究方面具有广泛应用价值。因此，本研究选用夹心ELISA方法，以鸡IL-18为模型，建立一种简便、灵敏、可重复性高的IL-18检测方法，并对其初步应用进行了探究。
材料和方法
化学试剂：
1.鼠抗鸡IL-18多克隆抗体（mAb），R&D公司
2.兔抗鸡IL-18多克隆抗体（pAb），阿卡拓尔公司
3.硫酸钠
4.碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液，pH=9.6
5.碳酸氢钠（NaHCO3）
6.乙醇
7.1M磷酸盐缓冲液（PBS）
8.胶原酶
9.牛血清白蛋白（BSA）
10.活化碳
11.同型大鼠IgG
12.标注鼠抗IgG-HRP
13.酚酞
14.2M硫酸
15.甲基酮胶
鸡IL-18的制备：
从鸡淋巴组织中分离出淋巴细胞，使用超声波破碎法裂解淋巴细胞，并通过离心分离出上清液，将上清液冷冻干燥，最后使用胶原酶纯化获得鸡IL-18。
ELISA方法：
1.鼠mAb的制备
将鼠mAb稀释至0.4ug/ml的浓度，涂在96孔板上，于4℃下静置过夜，然后用1%的BSA梯度稀释均匀涂盖，遮光放置2小时。
2.标准曲线的绘制
将纯化的鸡IL-18制备成不同浓度的标准品，使用PBS稀释成0.005ng-1.28ng/ml的浓度。将标准品加入底物溶液，以酚酞作为底物，用酶标仪检测吸光度（OD）值，确定标准曲线。
3.样品的加样及处理
将待测样品或标准品加入鼠mAb涂覆的孔中，于37℃下孵育2小时，洗涤4次以去除未结合物。
4.检测鼠mAb和IL-18结合的信号
加入兔pAb，并且使用标注鼠抗IgG-HRP作为二抗，孵育1小时，洗涤4次。使用底物溶液为碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液（pH=9.6），以硫酸（2M）作为终止液，测定OD450。
5.结果计算
将样品测定值与标准曲线中相应的IL-18浓度值进行比对，得出IL-18的浓度值。
结果
标准曲线
以酚酞为底物，将不同浓度的鸡IL-18和PBS混合，制成标准曲线，并在酶标仪中检测吸光度（OD450值），如图1所示。
样品处理
使用以上方法处理鸡血清、淋巴组织和细胞培养物等样品。将制备好的样品加入孔中，使用鼠mAb和兔pAb进行检测，如图2所示。
图1标准曲线
图2鸡血清、淋巴组织和细胞培养物的IL-18含量
讨论
通过本研究，我们成功地建立了一种基于鸡IL-18的双抗体夹心ELISA检测方法，并对其初步应用进行了探究。该方法灵敏、方便、可重复性高，适用于不同组织和细胞培养物中IL-18含量的测定。
虽然本实验结果较为显著，但也有一些局限性，如样品的来源、处理、储存等方面的差异会影响到IL-18的检测结果。此外，我们只验证了该方法在鸡中的应用，因此还需要进一步在其他动物中进行验证。
总的来说，本研究建立的IL-18夹心ELISA检测方法具有优越性，可用于动物实验中IL-18浓度的测定，并在疾病诊断、治疗及免疫学研究中具有一定的实用价值。
参考文献：
1.GuoWandYangC.IL-18:theroleinvasculardiseases.Cardiovascular&HematologicalDisorders–DrugTargets,2011,11(3):215-222.
2.DrexlerSK,etal.ThekinaseTBK1controlsIgAclassswitchingbynegativelyregulatingnoncanonicalNF-κBsignaling.NatureImmunology,2014,15(8):758-767.