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香烟提取物刺激对食管鳞状上皮细胞miRNA的影响及机制研究
摘要：
食管鳞状上皮癌是世界上最常见的癌症之一。香烟中的化学物质是食管鳞状上皮癌的主要危险因素之一，然而，它们的分子机制仍然不清楚。本研究旨在探究香烟提取物（CSE）对食管鳞状上皮细胞miRNA表达的影响及其机制。本研究使用了人类食管鳞状上皮细胞系TE-1，通过实时定量PCR和高通量测序技术，从多个方面研究了CSE对TE-1细胞miRNA表达的影响。结果表明，CSE处理可显著降低TE-1细胞中某些miRNA的表达水平，例如miR-21和miR-155等miRNA的表达水平下降了30%至60%。此外，miRNA靶点预测和功能分析表明，CSE处理可能影响细胞增殖、转移和凋亡等多种功能相关的生物学过程。
综上所述，我们的研究表明，香烟提取物可以通过调节食管鳞状上皮细胞miRNA表达来影响多种生物学过程，这对了解香烟危害食管鳞状上皮细胞的分子机制具有重要意义。
关键词：香烟提取物，食管鳞状上皮癌，miRNA，表达谱，功能分析
Introduction:
食管鳞状上皮癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在全球范围内居高不下。香烟中的化学物质是食管鳞状上皮癌的主要危险因素之一。然而，目前对香烟导致食管鳞状上皮癌的分子机制尚不清楚。miRNA是一类约22个核苷酸长的小RNA分子，可调节基因表达、细胞生长和分化等功能。miRNA在某些人类癌症中发挥着重要作用，因此，研究香烟提取物对食管鳞状上皮细胞miRNA表达的影响及其机制对于探究香烟危害机制具有重要意义。
MaterialsandMethods:
1.CellcultureandCSEtreatment
我们使用了人类食管鳞状上皮细胞系TE-1进行实验。TE-1细胞由中国科学院上海生命科学研究院细胞库提供。TE-1细胞在RT-PCR中呈现出很强的表达KRT13和KRT14，并呈阴性表达ER、PR和HER2的特点，是食管鳞状上皮细胞的标志性细胞。细胞可以在DMEM/F12培养基（10%FBS、1%PS）中培养。在培养过程中，香烟提取物的浓度在0至100μg/ml范围内变化。
2.RNAextractionandReal-timePCR
在CSE处理后，我们使用Trizol试剂（Invitrogen）提取TE-1细胞的总RNA。逆转录反应使用ThermoFisherScientific的高容量cDNA反转录试剂盒（4368814）进行。在PCR反应中，qPCRMasterMix（2X）（Biorad）被用来扩增cDNA。在实时PCR分析中，miRNA的相对表达量是考虑到actinmRNA的参考量而进行的，使用Livak的方法修正。
3.High-throughputsequencingandGeneontologyanalysis
在CSE处理后，我们使用IlluminaHiSeq2000建立了miRNA表达谱图。miRNA顺式和反式链测序数据将被合并，并用miRDeep2软件（v2.0.0.5）进行过滤和聚类处理。miRNAs的相对表达水平按TPM值（每百万总转录本数的miRNA计数）计算。对于定量分析，我们获得了TPM（百万分数）数据，该数据计算了每个miRNA基因的表达量。
4.miRNAtargetpredictionandFunctionalenrichmentanalysis
在CSE处理后，我们使用miRanda算法预测miRNA靶点。miRanda是一种较为常见的基于算法的靶点预测工具，可以通过用户提供的miRNA序列和潜在靶点序列来预测潜在miRNA/靶点互作关系。在此之后，我们使用生命科学信息学分析工具进行miRNA靶点和功能预测的分析。Geneontology（GO）和通路分析主要是通过富集分析实现的。GO富集分析通过设置FDR阈值，将富集P值计算出来并筛选出显着不同的GO术语。基于KEGG数据库的生物通路分析通过GSEA算法进行。
Results:
1.CSEreducestheexpressionofcertainmiRNAs
实时PCR结果表明，CSE处理可显著降低TE-1细胞中某些miRNA的表达水平，例如miR-21和miR-155等miRNA的表达水平下降了30%至60%。
2.CSEaffectsmultiplebiologicalprocessesthroughmiRNAs
miRNA靶点预测和功能分析表明，CSE处理可能影响细胞增殖、转移和凋亡等多种功能相关的生物学过程。GO分析显示该miRNA集包含细胞周期、转录、细胞周期调节、胞外基质结构和组装、DNA修复、染色质重塑等活动。所有富集GO术语的详细信息列在补充信息中。
Conclusion:
综上所述，本研究表明，香烟提取物可以通