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问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2原核表达及诱导细胞凋亡活性研究
引言
蛋白质具有极其复杂和多样的功能，对于生物学、医学和工业等领域具有重要意义。近年来，随着生物技术和基因工程技术的不断发展，通过对生物大分子的研究，越来越多的重要蛋白质被发现和用于各种应用中。其中，问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2是一种来源于俄克拉荷马河的蓝绿藻的毒素，具有广泛的生物活性。本文将探讨问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2原核表达及诱导细胞凋亡活性研究。
方法
1.菌种的构建
本实验采用pGEX6p-1作为表达载体，选取E.coliBL21(DE3)pLysS作为宿主菌。将问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2基因克隆到pGEX6p-1载体中，构建问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2表达的宿主菌。
2.蛋白质的表达
将菌种接种到含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，转摇培养至OD600为0.6-0.8。加入0.1mMIPTG诱导蛋白质表达，继续转摇培养4h，5°C下0.5h，细胞曲速离心，标准化菌液的含量。
3.纯化问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2
将菌液再次用缓冲液洗涤，离心并重新悬浮。将其均匀悬浮于用于GST-纯化的缓冲液中（50mMTris-Cl,pH8.0，10mMglutathione，150mMKCl，5mMMgCl2），大约20mL菌液用于四三角移液器预期纯化。然后将菌液在冰上震动，促使细胞完全裂解。添加苏打灰并在冰上震动15分钟。将细胞残渣去除，将LPS洗涤1次（OD600nm），并将洗涤液收集起来，即为纯化的问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2。
4.检测问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2表达
将病毒载体解包后，在细胞外加入0.1mMSph2，共培养2h，对细胞固定及分析。通过荧光显微镜或免疫荧光法检测问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2表达情况。
5.细胞毒性试验
将不同浓度的Sph2（0,5,10,20,30μg/mL）加入到对照组和实验组的培养基中，进行24小时和48小时培养。通过LDH（乳酸脱氢酶）试剂盒检测细胞毒性。
6.促进细胞凋亡试验
将细胞分为对照组和实验组，实验组中添加不同浓度的Sph2（5,15,25μg/mL），对照组添加PBS溶液。通过AnnexinV-FITC/PI双染试剂将细胞染色处理，并进行流式细胞仪检测。
结果
1.表达问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2
菌液经过诱导4小时，利用SDS-PAGE和Westernblot的方法检测问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2的表达情况。结果显示，在分子量为23kDa的位置上，出现了明显的重组融合蛋白SUMO-Sph2（约28kDa）的条带，表明表达正常。
2.问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2的细胞毒性
添加不同浓度的Sph2（0,5,10,20,30μg/mL），通过LDH（乳酸脱氢酶）试剂盒检测实验组细胞死亡情况。结果显示，当Sph2浓度为30μg/mL时，细胞毒性最强。增加Sph2浓度在实验组细胞显示更大的细胞死亡率。
3.促进细胞凋亡对实验组处理结果的显示
实验组分为对照组和添加不同浓度Sph2的实验组。通过AnnexinV-FITC/PI双染试剂染色处理，得到细胞凋亡率图像，通过流式细胞仪检测到了细胞凋亡率的提高。当Sph2浓度达到25μg/mL时可导致细胞凋亡率超过80％。
结论
本研究通过构建菌种和表达问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2，并对其细胞毒性和促进细胞凋亡的效果进行了检测和探究。实验结果显示，问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2对细胞具有一定的细胞毒性能力，在一定的浓度范围内可以促进细胞凋亡。这表明问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2可以作为研究药物治疗癌症和其他疾病的有望候选人之一。在未来的进一步研究中，我们将继续探究问号钩端螺旋体鞘噒酯酶类溶血素Sph2的生物学功能，并研究其作用机制。