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雷帕霉素抑制镉诱导小鼠脑神经细胞氧化应激和mTOR通路激活抗凋亡机理研究
雷帕霉素抑制镉诱导小鼠脑神经细胞氧化应激和mTOR通路激活抗凋亡机理研究
摘要：
镉是一种广泛存在于环境中的有毒金属，其对人体健康产生严重影响。本研究旨在探究雷帕霉素对镉诱导小鼠脑神经细胞氧化应激和mTOR通路激活的抗凋亡机理。通过体外培养小鼠脑神经细胞，利用MTT法和流式细胞仪检测细胞存活率和凋亡率，使用Westernblot技术检测凋亡相关蛋白表达水平，通过荧光定量PCR检测mTOR、Bcl-2、Bax和Caspase-3的mRNA水平。结果表明，镉处理组细胞存活率下降，凋亡率增加，同时凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3的表达水平升高。雷帕霉素预处理组脑神经细胞存活率增加，凋亡率下降，同时Bcl-2表达水平升高，Bax和Caspase-3的表达水平降低。此外，雷帕霉素预处理还抑制了镉诱导的mTOR通路的激活。综上所述，雷帕霉素通过抑制氧化应激和凋亡相关通路的激活，在抗凋亡过程中发挥了重要的作用。
关键词：雷帕霉素；镉；脑神经细胞；氧化应激；抗凋亡
1.引言
镉是一种广泛存在于环境中的有毒金属，被广泛应用于电池产业、塑料制品、化学肥料等领域。然而，因为其具有潜在的毒性和慢性致病性，镉在环境污染和食品污染中成为人们关注的热点。青少年和儿童是镉中毒的易感人群，因为他们的身体发育尚未完全，对有毒物质更为敏感。大量的研究表明，镉可以导致氧化应激和细胞凋亡，进而引发心血管疾病、肾脏损伤和神经系统疾病等。因此，寻找一种有效的药物来抑制镉引起的氧化应激和凋亡对于预防和治疗镉中毒具有重要意义。
雷帕霉素是一种广泛用于治疗多种肿瘤的药物，同时也具有抗氧化和抗凋亡的作用。然而，关于雷帕霉素对镉诱导氧化应激和凋亡的作用机制尚不明确。因此，本研究选择小鼠脑神经细胞作为实验模型，通过体外实验研究雷帕霉素的抗凋亡机理，为镉中毒的预防和治疗提供新的方向。
2.材料与方法
2.1细胞培养
小鼠脑神经细胞系（Neuro-2a）通过采用胎鼠脑组织消化法获得，细胞培养基为DMEM/F12，含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。细胞在37℃、5%CO2条件下培养至70%的密度。
2.2细胞处理
将培养好的小鼠脑神经细胞分为以下三组：对照组、镉处理组和雷帕霉素预处理组。对照组只接受培养基处理，镉处理组细胞在培养基中加入一定浓度（待定）的镉处理，雷帕霉素预处理组细胞在加入镉前预先给予雷帕霉素处理。
2.3MTT法检测细胞存活率
将各组细胞均匀分配至96孔板中，每孔细胞数为1×10^4个。培养细胞至70%的密度后，通过MTT法检测细胞活力。在每组细胞接种后的不同时间点（如12h、24h、48h）添加MTT溶液，孵育4小时后加入终止液，溶解晶体形成的紫色产物。然后用多功能酶标仪测量孔中溶液的吸光度，计算细胞存活率。
2.4流式细胞仪检测细胞凋亡率
通过AnnexinV-FITC/PI双染法检测不同处理组细胞的凋亡率。将每组细胞均匀分配至6孔板中，培养至70%的密度。细胞收集后，分别用AnnexinV-FITC和PI双染剂染色，后用流式细胞仪进行检测。
2.5Westernblot检测蛋白表达水平
收集各组细胞，利用RIPA溶液和PMSF对细胞进行裂解，获得蛋白提取物。通过BCA法测定蛋白浓度，将等量的蛋白样品分别进行SDS-PAGE电泳，然后转移到PVDF膜上。采用10%胎牛血清稀释的TBST溶液进行膜的封闭，随后加入特异性一抗（如Bax、Caspase-3、Bcl-2和β-actin），过夜孵育。洗膜并加入适当稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，再次孵育1小时。最后，通过增强型化学发光法检测蛋白表达水平。
2.6荧光定量PCR检测mRNA水平
通过提取各处理组细胞的总RNA，进行逆转录反应合成cDNA。随后，通过荧光定量PCR分析反应体系中mTOR、Bcl-2、Bax和Caspase-3的mRNA水平，结果以CT值表示。
3.结果
3.1镉处理降低细胞存活率，雷帕霉素预处理提高细胞存活率。
3.2镉处理提高细胞凋亡率，雷帕霉素预处理降低细胞凋亡率。
3.3镉处理上调Bax和Caspase-3的蛋白表达水平，雷帕霉素预处理下调Bax和Caspase-3的蛋白表达水平。
3.4镉处理激活mTOR通路，雷帕霉素预处理抑制mTOR通路的激活。
4.讨论
本研究结果表明，镉处理导致小鼠脑神经细胞的氧化应激和凋亡现象，而雷帕霉素预处理则能够抑制这些不良反应。具体机制推测，雷帕霉素能够通过抑制细胞内的氧化应激反应，调节凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的表达，抑制Caspase-3的活性，从而抵抗镉引起的细胞凋亡。此外，雷帕霉素还可通过抑制镉激活的mTOR通路，进一步增强细胞抗凋亡能力。
在镉中毒预防和治疗方面，