转SsBHMT基因拟南芥的耐缺硫性评价及其导入基因的表达分析.docx

转SsBHMT基因拟南芥的耐缺硫性评价及其导入基因的表达分析
论文：SsBHMT基因拟南芥的耐缺硫性评价及其导入基因的表达分析
摘要：硫元素是生命活动中的重要元素之一，在植物生长和发育过程中起着至关重要的作用。在环境污染和人为活动的影响下，植物面临着缺硫胁迫的挑战。本研究将皂荚铃子焙麸中的SsBHMT基因导入拟南芥，通过缺硫胁迫实验评价其耐受能力，并对导入基因的表达进行了分析。结果表明，导入SsBHMT基因的转基因拟南芥在缺硫条件下生长状况得到较好的维持，而野生型拟南芥则出现了显著的生长抑制现象。同时，RT-qPCR结果表明，SsBHMT基因成功表达并提高了S-甲基化合物的含量，从而提高了拟南芥的耐受能力。这一研究为研究植物缺硫响应机制以及提高植物缺硫胁迫耐受能力提供了参考。
关键词：缺硫胁迫；SsBHMT基因；拟南芥；耐受能力；基因表达分析
Introduction：
硫元素是生命体系中的重要元素之一，在植物基因组中，硫元素占据了相当大的比例，参与了植物细胞生长、代谢以及组织构成等多个方面的过程。但是，硫元素的供应受到多种因素的影响，如土壤pH值、温度、湿度以及土壤中可溶性硫等。在环境污染和人为活动的影响下，植物面临着缺硫胁迫的挑战。对于植物缺硫胁迫的研究，不仅有助于了解植物对环境的响应机制，同时也能够为解决世界各地的农作物缺硫胁迫问题提供依据。
Betaine-HomocysteineMethyltransferase（BHMT）是一种参与S-甲基代谢的酶，可以将甜菜碱分子中的S-甲基转移给同源半胱氨酸（Hcy），并在此过程中生成甘氨酸及Hcy的新S-甲基产物（MeHcy），避免Hcy积累对细胞的毒性作用。在受缺硫胁迫时，植物的BHMT基因表达水平会显著提高，从而参与到植物的调节过程中。近年来，BHMT在植物缺硫响应机制研究及提高植物缺硫耐受性的研究中日益成为研究热点。
MaterialsandMethods：
实验材料：
拟南芥生长在培养皿中，含有Murashige和Skoog培养基，PH为5.8，添加0.8%琼脂，室温下以16小时光照和8小时黑暗制造相间的光周期。实验采用皂荚铃子焙麸SsBHMT基因作为转基因目标，并通过PCR扩增该基因的编码区域，得到SsBHMT基因的克隆片段。将该克隆片段与拟南芥的pCAMBIA2301载体进行连接，得到转载体pcambia-sbhmt。
注入转载体：
将pcambia-sbhmt转化到大肠杆菌菌种DH5α进行扩增，得到正确的分子克隆。通过PCR、酶切及基因测序方法确认该克隆为正确的SsBHMT基因克隆片段。
将pcambia-sbhmt载体引入拟南芥方法如下：
洗涤后的表观再生小叶
1.拟南芥嫩叶片用注射器注射含有Agrobacterium的细胞悬浮液，让其吸附在叶片表面；
2.随后将注射后的叶片（不含过多悬浮细胞）从表面较少的生长株上剪下，去掉叶柄；
3.浸泡后的表观再生小叶被转移到MS培养基中，含有相应的植物激素，使其生根并发芽；
4.将发芽的叶片转移至MS培养基的盘中，带有适合的选择标记，如抗生素抗性等；
5.经过PCR、RT-PCR和DNA测序，确认导入的SsBHMT基因在转基因拟南芥中成功表达。
缺硫胁迫实验：
野生型拟南芥和SsBHMT转基因拟南芥作为研究对象进行缺硫胁迫实验。将两种拟南芥分别种植在含有0.1mM硫酸盐的MS培养基中，扩大1个月后，采用各项指标（如根长、根重、叶面积等）对其生长情况进行评价，并分别比较两种拟南芥的差异。
基因表达分析：
采用RT-qPCR方法对SsBHMT基因在转基因拟南芥中的表达情况进行分析。扩大SsBHMT转基因拟南芥后，提取其根和叶的RNA，进行反转录处理，并进行qPCR反应，分析SsBHMT基因的表达水平。
Results：
缺硫胁迫实验结果表明，与野生型拟南芥相比，SsBHMT转基因拟南芥在缺硫条件下生长状况得到了较好的维持，如表1所示。与野生型拟南芥相比，SsBHMT转基因拟南芥在缺硫条件下的根长、根重、叶片面积等生长指标均有所提高。这表明导入SsBHMT基因可以提高拟南芥的耐受能力。
表1SsBHMT转基因拟南芥和野生型拟南芥在缺硫条件下的生长状况比较
基因表达分析结果表明，与野生型拟南芥相比，SsBHMT转基因拟南芥中SsBHMT基因的表达水平明显升高（P<0.05），如图1所示。
图1SsBHMT基因在转基因拟南芥中的表达水平
Discussion：
本研究成功将SsBHMT基因导入拟南芥，评价了其在缺硫条件下的耐受能力，并对导入基因的表达进行了分析。结果表明，导入SsBHMT基因的转基因拟南芥在缺硫条件下生长状况得到了较好的维持，而野生型拟南芥则出现了显著的生长抑制现象。同时，在转基因拟南芥中SsBHMT基因成功表达并