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茶多酚氧化酶基因的克隆及其工程菌的构建
茶多酚氧化酶基因的克隆及其工程菌的构建
摘要：
茶多酚氧化酶是参与茶叶生长、发酵和加工的关键酶之一。本文中，我们通过PCR技术先将茶多酚氧化酶基因进行克隆，并将其插入到表达载体pET28a中。接着使用大肠杆菌进行重组表达，并通过Westernblot实验和酶活性测定对目标蛋白进行鉴定和活性评估。实验结果表明，我们成功克隆出了茶多酚氧化酶基因，构建了高效表达的工程菌，并且其酶活性也与自然酶相似，具有未来在饮料、食品等领域的广泛应用前景。
关键词：茶多酚氧化酶，克隆，工程菌，表达载体，酶活性
引言：
茶叶是一种非常受欢迎的饮料，其中的茶多酚是茶叶天然的生物活性物质之一，具有抗氧化、抗肿瘤、降血压和降胆固醇等多种生理功能。而茶多酚氧化酶（EC1.10.3.1）则是茶叶生长和加工过程中非常重要的酶，它能够将茶多酚氧化成为黄色物质并影响茶叶的色泽和口感。
为了满足工业需求，生产出更优质的茶制品，我们需要更好地了解茶多酚氧化酶的遗传学特征和分子机制。本文中，我们通过PCR技术克隆出茶多酚氧化酶基因，并构建了高效表达的工程菌。最后，通过Westernblot实验和酶活性测定，我们对工程菌表达的目标蛋白进行了鉴定和活性评估。
材料与方法：
克隆茶多酚氧化酶基因：
我们从绿茶的鲜叶中提取总RNA，通过RT-PCR技术合成cDNA。接着，使用特异性引物扩增所需基因片段。引物为：Forward：5’-ATGGAACAAGATGCTGGCAGGC-3’；Reverse：5’-CTAAATTTCTGAACAGCATCCT-3’。PCR反应体系为：2×TaqMasterMix25μl、RNA模板1μg、Forward/Reverse引物各0.5μl、ddH2O调整至50μl。PCR条件为：95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，72℃10min。PCR片段纯化后进行测序。
构建工程菌：
茶多酚氧化酶基因与表达载体pET28a使用T4DNA连接酶进行融合连接，构建工程质粒pET28a-TPOD。接着将重组质粒pET28a-TPOD转入大肠杆菌BL21中，培养温度为37℃，过夜培养。
酶活性测定：
收集工程菌后，采用超声裂解法将细胞破碎并离心收集上清液，使用比色法进行测定。每种酶样分别在5000、10000、15000、20000、25000、30000μg/mL茶多酚浓度下，加入1mL酶液和1mL酶反应缓冲液进入反应器，设置在30℃下反应15min。最后，通过比色法测定反应混合物中还原亚甲基的含量，从而推算出不同酶样的活性。
Westernblot实验：
采用SDS-PAGE方法将纯化的蛋白进行分离，并将分离出的蛋白转移到0.45μmPVDF膜上，接着加入10%的蛋白过渡液进行1小时封闭。接着，使用TPOD鉴定抗体进行Westernblot实验，检测目标蛋白在膜上的定位。
结果：
茶多酚氧化酶基因克隆：
使用特异性引物，我们成功地扩增出了茶多酚氧化酶的基因片段。PCR片段呈现出明显的单条带，大小约为2.3kb（图1）。
图1茶多酚氧化酶基因PCR扩增片段
工程菌构建：
我们使用PCR产物将茶多酚氧化酶基因从载体中切割出来，并与pET28a载体进行拼接，最终构建了pET28a-TPOD重组质粒。接着将重组质粒转入大肠杆菌BL21中，并用含有50mg/L的培养液进行培养，最终得到了大肠杆菌工程菌BL21/pET28a-TPOD（图2）。
图2工程菌BL21/pET28a-TPOD
酶活性测定：
破碎工程菌并使用酶活性测定法对其进行鉴定，结果表明茶多酚氧化酶的活性与自然酶相当。酶活性与酶样的浓度呈正相关，活性最高达到323U/mg（图3）。
图3TPOD华北地区茶园中差异的茶多酚氧化酶活性分布
Westernblot实验：
Westernblot实验结果表明，靶蛋白可以与TPOD鉴定抗体结合，出现了明显的蛋白带，证明我们成功地表达出了茶多酚氧化酶的目标蛋白（图4）。
图4Westernblot检测表达的茶多酚氧化酶蛋白
讨论：
本研究中，我们首先克隆了茶多酚氧化酶基因，并成功构建了高效表达的工程菌BL21/pET28a-TPOD，酶活性表现出良好的稳定性和活性。茶多酚氧化酶在抗氧化、改良色、香、味等多个方面均有广泛的应用，并且在食品和医学领域都具有很高的研究和应用价值。通过之前的研究，我们可以发现，茶叶中茶多酚的含量对于茶叶品质的影响非常巨大，因此对于茶叶生长、发酵和加工等方面，茶多酚氧化酶的研究与改良将会有着重要的应用前景和意义。
结论：
通过PCR技术克隆了茶多酚氧化酶基因，并将其插入到表达载体pET28a中。接着使用大肠杆菌进行重组表达，并通过Westernblot实验和酶活性测定对