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草原湿地土壤总DNA提取方法及其在氨氧化微生物研究中的应用
摘要：
草原湿地作为一种特殊的生态系统，包含着丰富的微生物种群，其中的氨氧化微生物是维持湿地氮循环平衡不可或缺的微生物群落。本文设计了一种基于土壤总DNA提取的方法，旨在为氨氧化微生物的研究提供有效的技术支持。该方法采用硅胶柱纯化和琼脂糖凝胶电泳鉴定相结合的策略，顺利地从草原湿地土壤中提取到了高质量的总DNA，并得到了较为明确的电泳图谱。进一步的PCR扩增和克隆测序结果表明，该方法在强调DNA提取的同时并未影响到氨氧化微生物的种类及其多样性，因此适用于草原湿地氨氧化微生物的总DNA提取和进一步分析。
关键词：
草原湿地；总DNA提取；氨氧化微生物；PCR扩增；克隆测序
引言：
草原湿地是一种特殊的生态环境，在其内部存在着大量的微生物群落。其中的氨氧化微生物是维持整个湿地氮循环平衡的重要成分。以往的研究中，采用的是通过文化方法提取氨氧化微生物群落，然后进行分子生物学研究的策略。这种方法虽然能够做到对于目标微生物的选择和分离，但是其不能反映整个湿地微生物多样性的全部，因此需要开发一种能够同时获取全面微生物群落信息的技术方案。本研究主要旨在设计一种土壤总DNA提取方法，以期用于氨氧化微生物的群落分析。
材料和方法：
1.样品采集
采用了典型的草原湿地样品，样品采集过程中，需要彻底清除采样器和检测手套的油脂、污垢等杂质，避免干扰后续实验操作的步骤，确保提取到的DNA质量更好。
2.土壤样品处理
将土壤样品均匀摇匀，取出5g土壤样品于洁净的研钵内加入18mLTris-EDTA缓冲液(TE)悬浮混合，摇匀后带缓慢转动振荡器振荡60min，放置3min使土壤颗粒沉淀于液面以下，取上清液备用，提取总DNA的方法详见以下步骤。
3.土壤总DNA提取
将上清液过滤(0.22um)得到悬浮液，悬浮液进行酚/氯仿法提取。塞姆定量后将DNA溶液在琼脂糖凝胶电泳仪上进行质量和纯度检测。
4.琼脂糖凝胶电泳鉴定
将提取得到的DNA试剂加入1%琼脂糖糖酸钠胶体电泳试剂，分别注人琼脂糖凝胶管中，经过电泳分离凝胶后，检测其电泳结果，以确定样品DNA质量，纯度等。
5.PCR扩增和克隆测序
将从湿地土壤中提取到的总DNA加入PCR体系中进行PCR扩增，进一步克隆测序。
结果和讨论：
采用本研究设计的土壤总DNA提取方法，从草原湿地样品中提取到了较高质量总DNA，琼脂糖凝胶电泳结果显示明确的DNA清晰带。在进一步扩增和克隆测序等的操作中，得到了大量的氨氧化微生物相关序列，这些序列不仅丰富，而且样品间差异显著。这些结果充分证明了本研究中总DNA提取方法的可行性和有效性。同时，本方法无需进行微生物群落分离和筛选等步骤，因此可以更直接地从地理与土壤环境等角度评估微生物群落特征，更好地评估微生物对湿地生态系统的影响。
结论：
本研究设计的土壤总DNA提取方法基于硅胶柱纯化和琼脂糖凝胶电泳鉴定相结合的策略，为草原湿地中氨氧化微生物的研究提供了有效的技术支持。这种方法可直接从土壤中提取到高质量的总DNA，并得到较为明确的DNA电泳图谱，为草原湿地微生物特征研究提供了基础数据的支撑。