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脂氧素A4对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞通透性的影响
摘要
脾氧素A4（LXA4）是一种免疫调节分子，已证实其在多种疾病中展现出重要的生理作用。本文旨在探讨LXA4对脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）通透性的影响。实验结果表明，LPS可以明显增加HUVECs通透性，而LXA4可以显著减轻LPS所致的HUVECs通透性增加，且LXA4对HUVECs单层细胞结构及细胞内黏附分子的表达均无明显影响。本研究的结果为LXA4在治疗相关疾病中的临床应用提供了新的理论基础。
关键词：脾氧素A4，脂多糖，内皮细胞，通透性
引言
内皮细胞是近毛细血管处的一层薄而透明的细胞层,是血管与因脉管相依存的组织细胞之间的重要桥梁,它们控制着多种生理和病理过程（1,2）。当血管内皮细胞接受到有害刺激,如脂多糖(LPS),它们会产生一种反应，导致细胞膜微小或大的孔或缝隙的形成,从而使血液成份对组织间隙的渗出率增加，进而影响血管内的物质代谢和组织血流的分布调节(3,4)。因此，对控制内皮细胞通透性的分子机制进行深入研究具有临床意义。
脾氧素A4（LXA4）是一种内源性抗炎免疫调节分子，具有广泛的生理作用，包括抑制炎性细胞浸润、降低细胞凋亡、促进组织修复、增加膜单端氧鸟苷的合成及其他生理功能（5,6）。已经发现，LXA4可以通过调节内皮细胞间反应而发挥其抗炎作用（7）。在不同的炎症反应中,LXA4可通过其受体而对细胞间单元的相互作用产生有效的影响,因此我们通过实验探讨LXA4对LPS刺激下的HUVECs通透性的影响。
实验方法
材料及试剂
（1）脂多糖(LPS)极纯品（EscherichiacoliO111:B4）
（2）2010年埃及EscoMP公司提供的人脐静脉内皮细胞
（3）LXA4（CaymanChemical,AnnArbor,MI,USA）
（4）RPMI1640培养基（GibcoBRLCo，GrandIsland,NY,USA）
（5）胶原酶（Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA）
（6）RIPAlysis缓冲液（CellSignalingTechnology，Danvers,MA,USA）
（7）亚铁氰酸钾
分组及实验设计
（1）正常对照组(Con)
（2）脂多糖诱导组(LPS)
（3）脂多糖+脾氧素A4预处理组(LPS+LXA4)
将培养的人脐静脉内皮细胞平铺于96孔板中，在接近80％的时间点时添加LXA4。在接近满穷时添加100μL50μg/mL的LPS进入相应组细胞，并在74小时后评估细胞孔隙化的程度。在实验前处理静脉内皮细胞的密度为5×10^4个/ml。在实验进行时，紧随着各组添加LXA4，紧随着头60分钟、1,6,12,18,24,30,36,42,48,54和60小时检测细胞通透性的变化及收获。在实验后60小时，将细胞捞出并利用Enzyme-linkedImmunosorbentAssay(ELISA)试剂盒检测其抗氧化酶系统的活性。所有实验在保持本实验室统一的生物安全实验室标准操作下进行。
细胞通透性检测
细胞通透性测量用于评价体外血管内皮细胞通透性。细胞通透性实验由Millicell.的Transwell™96多孔板（MillicellTM多孔隔膜穿孔同心环板晶w/过滤器PULLPLUG配置使用）执行。
检测内皮细胞的黏附分子表达
通过流式细胞术检测内皮细胞的ICAM-1和VCAM-1表达情况。首先采用生物素化的一抗（反ICAM-1和VCAM-1TropoelastinTM）检测对应蛋白的细胞表达情况，随后加入荧光标记的PE-CyTM3细胞二抗，并用荧光显微镜观察细胞的表现。
结果
LPS显然可以强化HUVECs的通透性，但LXA4的加入则减弱了LPS诱导的通透性，这两组实验可在图1找到，分别代表着内皮细胞通透性和膜孔的形成。随后，通过Real-timeScanningElectromicroscopy（RTEM）观察细胞形态及微小孔隙。然而，我们的结果表明，LXA4并没有影响到HUVECs的细胞形态（图3），也没有影响到其黏附分子（ICAM-1和VCAM-1）表达的改变。
图1.HUVECs的通透性与膜孔形成程度的测量结果
图2.HUVECs中常见的膜孔结构
图3.LXA4未影响到HUVECs的表面分子表达及形态
讨论
本实验确定LXA4可以减轻LPS造成的内皮细胞通透性，并证实了LXA4抗炎及调节作用的生理学机制。LPS是一种非常典型的内毒素，因在细菌的细胞壁上存在而得名，有很强的致炎性作用,在动物体内大量积聚时会引起很多严重的疾病，本实验研究脂多糖对内皮细胞通透性的影响，更直接地反应了其对动物体内炎症反应程度的影响。
而不同于其他免疫调节分子，如前列腺素E、L-半胱氨酸和一氧化氮(N