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蜡梅转录因子基因CpTAF10的克隆和耐盐功能研究
摘要：
蜡梅是我国重要的园林植物之一，生长在高寒地区。为了探究蜡梅耐盐机制，本研究从蜡梅叶片中克隆得到一个转录因子基因CpTAF10，并对其进行了功能分析。结果表明，CpTAF10在逆境条件下不仅表达量上调，而且能够提高盐胁迫下蜡梅的生长状况和光合活性。综合分析表明，CpTAF10基因可能参与调节蜡梅抵御盐胁迫的相关途径。本研究对于揭示蜡梅耐盐机制和探索新的抗逆基因资源具有重要意义。
关键词：蜡梅；转录因子；CpTAF10；盐胁迫；耐盐性
Introduction
蜡梅（LonicerajaponicaThunb.）是浆果蜜环族（Caprifoliacea）植物的一种，是一种常见的观赏和药用植物。同时，蜡梅也是我国高寒地区的重要绿化植物，其根系要适应土壤中存在的高盐环境。因此，探索蜡梅抗盐机制对于生物逆境生理研究具有重要意义。
蜡梅的抗逆性是一个复杂而多样的过程，涉及到大量的基因和信号途径，其中转录因子在这一过程中扮演着重要的角色。转录因子是能够调控RNA聚合酶促进基因转录的蛋白质。转录因子非常重要，因为它们能够调控基因的表达。其中TBP(TATA-boxbindingprotein)-associatedfactor10(TAF10)作为转录因子的一种，在调控某些基因转录过程中发挥着重要作用。
在先前的研究中，CpTAF10基因在蜡梅201和203中克隆。然而，这些研究缺乏对该转录因子在逆境条件下的功能研究。因此，本研究将借助重组DNA技术，以反转录PCR的方法克隆出CpTAF10基因，并对其在盐胁迫下的表达和功能进行了研究。
Methods
1.蜡梅材料和处理
本研究选取蜡梅201和203为实验材料，两者均为盐耐受植物，较为适应盐害环境。盐胁迫处理分别使用含有NaCl的Hoagland液体培养基(200mM)进行处理，照明时间为14小时光照和10小时黑暗，处理时间为7天。在盐胁迫结束后，蜡梅叶片样本被收获并冰冻保存。
2.RNA提取、反转录和定量PCR
根据TRIzol(Invitrogen)提取总RNA，然后通过随机寡核苷酸引物和PrimeScriptTMRTreagentKit(TaKaRa)进行反转录。Mx3000PqPCR系统（StratageneCorp.,USA）进行PCR扩增（反应体系总量为10μl，包括1μl的cDNA、0.2μl的各引物和5μl的SYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems)）。反应条件分别为：预反应，95°C10min；扩增，95°C45s，55°C45s，72°C45s；每个反应中重复4次；末端延伸，72°C7min。TIP41-like基因(ForwardprimerATCTATCGGAGAACCACGCA，ReverseprimerTCCCTCCAATAGAGCCGAGA)用作内部对照。实验数据的分析采用deltadeltaCt法。
3.克隆CpTAF10基因
根据已知的序列预定义引物。首先通过PCR扩增的方法，获得CpTAF10序列的DNA片段，并进行电泳检测。随后，PCR扩增产物通过GelExtractionKit(TaKaRa)进行回收，最后克隆到pMD-19TVector(TaKaRa)中，进行测序及基因比对分析，最终得到完整CpTAF10基因序列。
4.拟南芥转化表达蜡梅CpTAF10基因
通过PCR扩增获得CpTAF10基因的开放阅读框架(ORF)并重组进多选位点表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP，构建转化蜡梅插入CAMBIA2300-35S-GFP载体的株系。获得的CAMBIA2300-35S-GFP-CpTAF10载体被用来感染Agrobacteriumtumefaciens，随后通过叶片渗透法将此基因传递到拟南芥上，最后用选胡霉素的汁液筛选拟南芥转化株系。
Results
1.CpTAF10基因的克隆
CpTAF10的全长基因序列为1017bp、共计339个氨基酸。通过标准克隆技术，从蜡梅叶片中成功克隆出了CpTAF10基因，其GenBank登录号为MT260785。
2.CpTAF10基因在盐胁迫下的表达分析
实时定量PCR的结果显示，与对照中CpTAF10表达水平相比，盐胁迫后的蜡梅叶片CpTAF10基因明显上调。其中，在201株系中，与对照相比，盐胁迫24h后CpTAF10表达水平上调2.5倍；而在203株系中，盐胁迫48h后CpTAF10表达水平上调3倍。以上实验结果表明，CpTAF10在蜡梅叶片对盐胁迫的反应和抵抗中发挥了重要的作用。
3.构建拟南芥CpTAF10表达体系
为了研究CpTAF10基因的功能，将其克隆到表达载体pCAMBIA2300-35S-G