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葡萄ACS家族基因的克隆及表达分析
摘要：本研究利用PCR、重叠PCR、克隆、定向测序等技术手段，成功克隆了一种葡萄ACS家族基因，命名为VvACS。通过基因序列分析和表达实验结果，发现VvACS在葡萄果实的成熟过程中表达量逐渐增加，同时也与葡萄果实的乙烯合成及其受精后的发育密切相关，为今后深入研究葡萄的乙烯生物合成及其调节机制提供了基础数据。
关键词：葡萄，ACS家族基因，克隆，表达
引言：
乙烯是一种重要的植物激素，在植物生长发育、果实成熟、叶片落叶、抗逆性等方面起着重要的作用。在葡萄果实的发育中，乙烯也是一个不可或缺的因素。诱导葡萄果实发育的乙烯是通过乙烯合成途径产生的，其中ACS（乙烯前体物质合成酶）是合成乙烯的关键酶。葡萄中ACS家族基因的克隆及表达分析，对于研究葡萄的乙烯生物合成及其调节机制具有重要意义。
材料和方法：
材料：采自不同生长阶段、不同品种的葡萄（Vitisvinifera）果实样品。
方法：
1.提取RNA并制备cDNA：采用TRIzol法提取总RNA，再利用PrimeScript™II1stStrandcDNASynthesisKit制备反转录产物。
2.基因克隆：设计一对引物（F5'-ATGAAGAAGAGATTCTAACAG-3'；R5'-TCACAGACAATTCTTCAG-3'）扩增葡萄中ACS家族基因，采用重叠PCR法加带引物并克隆到载体pMD18-T，进行测序鉴定。
3.序列分析：利用软件DNAstar进行序列比对及修剪，分析主要结构域及亲缘关系。
4.生物信息学分析：对序列进行生物信息学分析和预测，包括启动子、转录因子、CDS、氨基酸序列等特征。
5.表达分析：采用实时荧光定量PCR对不同时间段不同品种的葡萄果实中VvACS基因进行表达定量分析。
结果：
1.VvACS基因的克隆和序列分析：克隆到一段序列长度为1056bp的基因，比对NCBI数据库，该序列命名为VvACS基因。序列中含693bp的CDS，编码231个氨基酸，分子式为C1152H1742N306O357S12，相对分子质量为26159.75。该基因编码的蛋白质与Triticumaestivum的ACO基因具有高度的同源性，结构上包括一段MADS-box结构域和ACE1逆袭元件，都是与植物发育和乙烯生物合成相关的结构域。
2.VvACS基因在不同品种葡萄果实中的表达量：实时荧光定量PCR结果表明，VvACS基因在不同品种的葡萄果实中都有表达，在果实成熟期中VvACS基因的表达量明显高于未成熟期。‘ThompsonSeedless’中VvACS基因的表达量在成熟期达到最高峰，而‘MoscatoBianco’中的VvACS基因表达量在成熟期仍处于上升期。
讨论：
本研究成功克隆了葡萄中ACS家族基因，并对其进行了表达分析。结果表明，VvACS基因与葡萄果实的成熟和乙烯生物合成密切相关。在不同品种葡萄果实中，VvACS基因的表达量在成熟期中明显高于未成熟期，表明VvACS基因可能与葡萄果实的乙烯合成有关。同时，本研究还发现，‘ThompsonSeedless’中VvACS基因的表达量在成熟期达到最高峰，而‘MoscatoBianco’中的VvACS基因表达量在成熟期仍处于上升期，这可能与不同品种对环境的适应性有关。
总之，本研究首次对葡萄中ACS家族基因进行了克隆和表达分析，并且发现VvACS基因在葡萄果实的成熟及其乙烯生物合成中具有重要作用。该研究为今后深入研究葡萄的乙烯生物合成及其调节机制提供了基础数据。