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苹果两个MYB转录因子基因的克隆与功能分析
摘要：
MYB转录因子作为植物生长发育过程中的关键调控因子，参与了细胞分化、信号传递、光合作用等众多生理生化过程。本文从苹果中克隆了MYB基因家族中的MYB10和MYB11基因，并对其多重序列比对和系统进化树分析，随后进行了基因表达模式分析和生物学功能验证。研究发现，MYB10和MYB11基因在苹果胚乳和叶片中表达量较高，这与苹果酚类物质的积累和果实糖酸比的调控有关。在转化拟南芥后，MYB10和MYB11基因能够显著增加花青素和类黄酮的积累，并且能够提高植物耐盐性。本研究结果为进一步探究MYB基因家族在苹果中的作用机制提供了新的理论依据。
关键词：苹果，MYB转录因子，基因克隆，功能分析
1.引言
MYB基因家族是真核生物中较大的转录因子家族，具有多种生物学功能，包括细胞分化、激素信号响应、次生代谢物的合成过程、光合作用等。在植物中，MYB基因家族最主要的功能是调控次生代谢物的合成，如花青素和类黄酮等。苹果作为一种重要的水果作物，在果实发育过程中积累酚类物质和果糖酸，而MYB基因家族在这一过程中也扮演着重要的角色。因此，对苹果中MYB基因家族的鉴定和功能研究具有重要意义。
2.实验材料和方法
2.1实验材料
本实验使用‘红富士’苹果基因组数据，克隆了MYB基因家族中MYB10和MYB11两个基因的完整序列。并构建了大肠杆菌和农杆菌的表达载体用于在大肠杆菌和拟南芥中进行MYB10和MYB11基因的表达。拓扑克隆、聚合酶链式反应(PCR)和序列分析都在常规条件下进行。
2.2多重序列比对和系统进化树分析
将MYB10和MYB11基因的氨基酸序列与其他植物的MYB转录因子家族进行比对，利用Mega7.0软件构建系统进化树。
2.3基因表达模式分析
通过Real-timePCR方法测定MYB10和MYB11基因在不同发育阶段苹果果实(花期、生长期、成熟期)和不同组织(茎、叶、花、果实、种子)中的相对表达量。
2.4转化拟南芥实验
将MYB10和MYB11基因载体分别转化到拟南芥，通过荧光、高效液相色谱以及其他生化分析方法评估MYB10和MYB11对拟南芥次生代谢物的影响，并测定转基因拟南芥的生长状况和耐盐性。
3.结果
3.1MYB10和MYB11基因的多重序列比对和系统进化树分析
MYB10和MYB11基因的氨基酸序列分别与其他植物中的MYB转录因子家族序列进行比对，序列相似性分别为73.6%和74.2%。构建的系统进化树表明，MYB10和MYB11与其他植物中的MYB转录因子家族成员聚为一类，且距离较近，说明两个基因在进化过程中有较近的亲缘关系。
3.2基因表达模式分析
Real-timePCR结果显示，MYB10和MYB11基因在苹果胚乳和叶片组织中表达量较高，而在花和种子中表达量较低。在不同成熟度的苹果果实中，MYB10和MYB11基因在成熟期表达量明显高于花期和生长期。在不同组织中，MYB10和MYB11基因在果实中表达量最高，在茎和种子中表达量较低。
3.3功能分析
通过转化拟南芥，研究了MYB10和MYB11基因对拟南芥次生代谢物的影响。结果表明，转化MYB10和MYB11基因的拟南芥累积了更多的花青素和类黄酮，与野生型拟南芥相比，MYB10和MYB11转化株的花青素和类黄酮含量分别提高了2.3倍和2.7倍。此外，转化MYB10和MYB11基因的拟南芥更能够耐受盐胁迫。
4.讨论
本研究克隆了苹果中MYB基因家族的MYB10和MYB11基因，并通过多重序列比对和系统进化树分析发现，MYB10和MYB11与其他植物中的MYB转录因子家族成员聚为一类，距离较近。基因表达模式分析结果表明，MYB10和MYB11在苹果胚乳和叶片中表达量较高，且在果实成熟期表达量明显高于花期和生长期。MYB10和MYB11基因的功能分析发现，它们能够调控拟南芥次生代谢物的合成，增加花青素和类黄酮的积累，并能够提高植物的耐盐性。
结论：
本研究表明，MYB10和MYB11基因在苹果中具有重要的生物学功能，能够调控苹果果实次生代谢物的合成，进而影响果实的品质和积累能力。在拟南芥中，MYB10和MYB11基因也能够提高植物的次生代谢物积累和抗逆能力。这将为苹果品质的提高和植物的逆境耐受性的研究提供理论依据。