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猪TTV20RF1基因的原核表达以及间接ELISA检测方法的建立
猪TTV20RF1基因的原核表达以及间接ELISA检测方法的建立
摘要：
小型DNA病毒亚科Torquetenovirus（TTV）被发现与人类、家畜、野生动物中的许多疾病有关，但其生物学和致病机制仍未完全理解。其中TTV-20RF1是在猪中最常见的TTV亚型之一。本文旨在建立一种原核表达系统，用于表达猪TTV-20RF1基因，并开发一种间接ELISA检测方法，以便更好地研究TTV-20RF1的生物学特性以及其与疾病的关联。
研究方法
1.克隆TTV-20RF1基因并构建表达质粒
TTV-20RF1基因从猪血浆中提取，并用RT-PCR技术扩增获得。将获得的TTV-20RF1基因PCR产物克隆到pET-28a表达载体中，得到pET-28a/TTV-20RF1表达质粒，并通过限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定。
2.表达TTV-20RF1基因
将得到的pET-28a/TTV-20RF1表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。表达得到的蛋白经过SDS-PAGE电泳和Westernblot检测，使用了His-tag抗体确证了表达的蛋白的存在。
3.制备间接ELISA检测试剂盒
提取表达得到的TTV-20RF1蛋白并制备抗体。使用制备的抗体作为捕捉抗体，在96孔板上涂覆TTV-20RF1蛋白标准曲线和实验组样品的检测。
结果
1.成功克隆了TTV-20RF1基因并构建了表达质粒；
2.在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了TTV-20RF1蛋白；
3.制备的间接ELISA检测试剂盒能够较为快速和准确地检测到TTV-20RF1蛋白。
结论
本文成功建立了一种猪TTV-20RF1基因的原核表达系统，并开发了一种间接ELISA检测方法，能够可靠地检测TTV-20RF1蛋白，为深入研究TTV-20RF1的生物学和致病机制奠定了基础。
关键词
Torquetenovirus；猪；TTV-20RF1；基因表达；ELISA检测。
Abstract:
Torquetenovirus(TTV),asmallDNAvirussubfamily,hasbeenfoundtobeassociatedwithmanydiseasesinhumans,livestock,andwildlife,butitsbiologicalandpathogenicmechanismsarenotfullyunderstood.Amongthem,TTV-20RF1isoneofthemostcommonTTVsubtypesinpigs.TheaimofthisstudywastoestablishaprokaryoticexpressionsystemfortheexpressionofpigTTV-20RF1geneandtodevelopanindirectELISAmethodtobetterstudythebiologicalcharacteristicsofTTV-20RF1anditsassociationwithdiseases.
Method
1.ClonetheTTV-20RF1geneandconstructtheexpressionvector
TheTTV-20RF1genewasextractedfrompigplasmaandamplifiedbyRT-PCR.TheobtainedTTV-20RF1genePCRproductwasclonedintothepET-28aexpressionvectortoobtainthepET-28a/TTV-20RF1expressionvector,andwasidentifiedbyrestrictionenzymedigestionandDNAsequencing.
2.ExpressionofTTV-20RF1gene
TheobtainedpET-28a/TTV-20RF1expressionvectorwastransformedintoEscherichiacoliBL21(DE3)forinducedexpression.TheexpressedproteinwasdetectedbySDS-PAGEelectrophoresisandWesternblot,andthepresenceoftheexpressedproteinwasconfirmedusingHis-tagantibody.
3.PreparationofindirectELISAdetectionkit
ExtracttheexpressedTTV-20RF1proteinandpreparetheantibody.Usetheprepa