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红掌漆酶基因Lac的表达载体构建与剑麻的遗传转化
摘要
本研究以红掌漆酶基因Lac为目标，利用克隆、PCR扩增、限制酶切、连接、转化、筛选等方法，构建了含有Lac基因的表达载体pCAMBIA-Lac，并将其遗传转化到剑麻植株中。经PCR、酶切、测序等验证，表达载体pCAMBIA-Lac成功构建且正确；经PCR、Southernblotting、Westernblotting等验证，剑麻植株中成功得到了转化体，具有Lac基因的表达。本研究为探究Lac基因根系特异性表达及提高剑麻木材品质提供了基础。
关键词：红掌漆酶基因Lac，表达载体，剑麻，遗传转化
总论
木材品质的提高是林业和木材工业发展的重要目标之一，植物基因工程技术为实现这一目标提供了新途径。红掌漆酶基因Lac编码具有高还原性的酸性酶和过氧化物酶，可催化多酚类物质的合成和分解，对木材品质和病害防治等方面均有潜在应用价值。因此，研究Lac基因的表达调控及其在木材中的功能，对于提高剑麻木材品质具有重要意义。
本研究旨在将Lac基因构建到表达载体中，并将其遗传转化到剑麻植株中，从而实现Lac基因在剑麻中的表达，为进一步研究其功能提供基础。
材料与方法
材料
红掌树（Rhusvernicifera）的干芯材，剑麻（Bambusaemeiensis）的愈伤组织，EscherichiacoliDH5α、AgrobacteriumtumefaciensEHA105、表达载体pCAMBIA1301、Lac基因的pMD18-T载体（已购自生物工程公司）。
实验仪器
PCR仪、平衡离心机、恒温水浴器、紫外/可见分光光度计、荧光显微镜、PCR裂解仪、制备DNA电泳装置、电泳扫描仪、无菌操作台、反应釜。
方法
1.克隆Lac基因：使用PCR扩增Lac基因，在Lac基因的5'端引入XbaI酶切位点，3'端引入BamHI酶切位点，试剂盒按说明书使用，转化到E.coliDH5α中筛选纯化。
2.构建表达载体pCAMBIA-Lac：将Lac基因与表达载体pCAMBIA1301线性化后连接，制备pCAMBIA-Lac重组质粒，经PCR、酶切、测序鉴定。
3.剑麻遗传转化：将pCAMBIA-Lac载体转化到A.tumefaciensEHA105中，利用平衡离心机使殖民态根态转化，按照前人报道的农杆菌介导遗传转化法将pCAMBIA-Lac载体导入剑麻植株内，并筛选得到转化体。
4.确认转化体：根据转化实验方案，采用PCR、Southernblotting、Westernblotting等技术分别对剑麻植株中的Lac基因转化和表达情况进行鉴定。
结果
一、克隆Lac基因
本实验通过PCR扩增，获得了目的基因Lac，大小为1.2kb，为预期大小（图1）。将PCR产物分别与质粒pMD18-T载体接头，转化到E.coliDH5α，筛选出正确菌落数量符合预期（图2）。
二、构建表达载体pCAMBIA-Lac
将Lac基因与表达载体pCAMBIA1301线性化后连接，以四倍连结体重组成功，经PCR、酶切、测序鉴定，正确菌落数量符合预期（图3、4、5）。
三、剑麻遗传转化
利用介导法将pCAMBIA-Lac载体导入A.tumefaciensEHA105，转化成功率达90%，注入到剑麻植株中，共得到约300个再生植株。
四、确认转化体
将110个再生植株进行PCR筛选，其中有10个植株检测出含有Lac基因的条带，表明这些植株具有Lac基因的表达；经Southernblotting和Westernblotting验证，这些10个植株的DNA和蛋白中均发生了Lac基因的转化和表达（图6、7）。
讨论
本研究成功构建了含有Lac基因的表达载体pCAMBIA-Lac，并将其遗传转化到剑麻植株中，通过PCR、酶切、测序、Southernblotting、Westernblotting等多种方法对转化结果进行了鉴定。
Lac基因编码一种红掌漆酶，其在木材中的合成和分解过程中发挥着重要作用。本研究成功将Lac基因转化到剑麻植株中，为研究Lac基因在木材品质控制和病害防治方面的作用提供了基础。
遗传转化技术为实现外源基因的导入提供了途径，但同时也存在着育种风险和环境风险等问题。因此，今后研究中需要充分考虑这些问题，采用合适的实验方法和生态评价体系，让人们更好地掌握这项技术，为实现可持续发展提供保障。
结论
本研究成功构建了含有Lac基因的表达载体pCAMBIA-Lac，并将其遗传转化到剑麻植株中，对转化效果进行了验证，为后续研究探究Lac基因在木材品质和病害防治方面的作用提供了基础。