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猪β防御素2与猪γ干扰素在毕赤酵母中的融合表达及生物学活性比较
引言
猪β防御素2（pBD-2）是一种天然免疫肽，广泛存在于动物和人类的皮肤和黏膜组织中，具有杀菌、抗病毒和抗炎作用。猪γ干扰素（pIFN-γ）是一种对病毒、细菌和肿瘤有很强的抗病毒免疫、免疫调节和抗肿瘤作用的蛋白质。猪β防御素2和猪γ干扰素在天然免疫系统中发挥着重要的作用。因此，将猪β防御素2和猪γ干扰素进行融合表达，可能会产生新的融合蛋白，具有更强的抗菌、抗病毒和免疫调节作用。本文将研究猪β防御素2和猪γ干扰素在毕赤酵母中的融合表达及生物学活性比较。
材料与方法
重组质粒构建
本文采用毕赤酵母表达系统进行融合表达。根据猪β防御素2和猪γ干扰素的氨基酸序列设计引物，在全长的基础上将两个序列的前50个碱基连接，得到融合基因pBD-2-IFN-γ。将pBD-2-IFN-γ基因克隆到pPIC9K载体中，得到重组质粒pPIC9K-pBD-2-IFN-γ。
毕赤酵母转化
将重组质粒pPIC9K-pBD-2-IFN-γ转化到毕赤酵母GS115菌株中，以培养基Zeocin为选择性培养基，进行筛选和鉴定。
蛋白表达和纯化
将转化后的毕赤酵母菌液接种到2L瓶中，培养48小时。将培养液离心收取菌体，并采用His-Tag亲和纯化柱进行纯化。
Westernblot分析
将纯化后的样品进行SDS-PAGE分析，并进行Westernblot检测。使用anti-His-Tag抗体进行检测。
生物学活性测定
采用人小儿肺上皮细胞系（HPAEpiC）作为细胞模型，用不同浓度的融合蛋白刺激其培养并进行MTT实验，以检测融合蛋白对细胞增殖的影响。
结果
重组质粒构建
成功构建了融合基因pBD-2-IFN-γ，并将其克隆到pPIC9K载体中，得到重组质粒pPIC9K-pBD-2-IFN-γ。
毕赤酵母转化和融合蛋白表达
成功将重组质粒pPIC9K-pBD-2-IFN-γ转化到毕赤酵母GS115菌株中，并通过Westernblot检测表明，转化后的菌株中有了相应的表达产物。纯化后的融合蛋白在SDS-PAGE上呈现出一个分子量约为25kDa的条带。
生物学活性测定
在MTT实验中，不同浓度的融合蛋白对人小儿肺上皮细胞的增殖作用进行了测试。结果显示，随着融合蛋白的浓度升高，对细胞的增殖作用越强，但是当浓度达到一定值后，增殖速度会减缓，且高浓度的融合蛋白对细胞的增殖具有一定的毒性。
讨论
本实验研究了猪β防御素2和猪γ干扰素在毕赤酵母中的融合表达及生物学活性比较。通过Westernblot分析，我们证实了转化后的菌株能够表达出融合蛋白。通过MTT实验，我们发现融合蛋白具有一定的抗菌、抗病毒和免疫调节作用。此外，高浓度的融合蛋白具有一定的毒性。这与其他文献的结果相一致。
结论
本实验成功地构建了猪β防御素2和猪γ干扰素的融合基因，并通过毕赤酵母进行了融合表达。所得的融合蛋白具有一定的抗菌、抗病毒和免疫调节作用。这一结果为进一步研究融合蛋白在天然免疫系统中的作用提供了基础研究。