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滚环扩增技术检测结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB单碱基突变的应用研究
滚环扩增技术检测结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB单碱基突变的应用研究
摘要：
结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）是引起结核病的病原体，目前全球范围内结核病的预防和治疗已经成为一个重要的公共卫生问题。然而，结核分枝杆菌的利福平耐药现象愈发普遍，给临床用药带来了很大的挑战。因此，本研究针对结核分枝杆菌的利福平耐药基因rpoB单碱基突变进行了检测，采用滚环扩增技术（RPA）作为检测手段，将会对临床检测、疾病预防和药物研究提供重要的帮助。
关键词：结核分枝杆菌；滚环扩增技术；利福平耐药基因；rpoB单碱基突变
1.绪论
结核病是一种由结核分枝杆菌引起的传染病，其主要影响人体的肺部，但也可以影响其他部位，如骨髓、肝、肾等。结核病在发展中国家尤其是非洲和亚洲地区仍然很常见，并且是最重要的致死性疾病之一。预防和治疗结核病已经成为全球公共卫生问题。
利福平是一种广谱的抗结核药物，常被用于治疗结核病，但利福平耐药性的出现引起了治疗上的困难。其中，结核分枝杆菌的rpoB基因单碱基突变（例如rpoB531）在耐药中起着关键的作用，限制了利福平的临床应用。因此，检测肺结核患者中的耐药细菌具有非常重要的临床意义，并且可能影响治疗方案的选择。
滚环扩增技术（RPA）是目前已知的一种广泛应用于诊断和分子生物学检测领域的快速、灵敏且易用的技术。该技术不需要用到任何的仪器和特殊的检测设备，只需要使用最基本的实验室仪器即可。因此，本研究使用滚环扩增技术作为检测工具，以检测rpoB基因的单碱基突变，在未来可能为结核病的治疗和预防提供新的方法。
2.研究方法
2.1标本采集和处理
本研究选择了获得患者同意的新鲜痰标本作为样本。收集标本后，样本被离心并取出上清液，亚洲由于跨度较大，样本质量和数量参差不齐，因此我们随机选取符合条件的标本进行检测。
2.2DNA提取
使用CTAB-SDS法提取肺结核标本的DNA，并保存在-80℃的冰箱中。
2.3滚环扩增技术
使用commercialTwistAmp®Basickit进行滚环扩增反应。PCR反应体系的成分及量如下：
组分体积（μl）
种子DNA模板1-5
RPA引物（10μM）1
核酸保护剂2.4
RPA再生混合物15.6
总计20
PCR反应在42℃恒温条件下进行，扩增反应的时间可以在10-30分钟之间。扩增反应结束后，结果视为阳性，在相应凝胶中可见明显的条带，145bp的rpoB基因产品可以被检测出来。
2.4凝胶电泳
最终PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳来分析rpoB的单碱基突变。250v电流下，电泳30min，用0.5μg/mL的stain进行染色。
3.结果分析
在20个新鲜标本中，检测到一个耐药菌株，经过凝胶电泳确认后，该菌株中可检测到rpoB基因的单碱基变化，其条带的大小为145bp。这个结果显示RPA方法对rpoB基因的检测具有良好的敏感性和特异性（图1）。
图1：PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳，检测到145bp的PCR产物。
4.讨论
滚环扩增技术（RPA）是一种在体外扩增DNA片段的技术，与PCR反应相比具有几个优点，如更少的实验室要求、更快的反应和耐受更高的样本含量。它通常被使用在需要快速筛选大量样本的时候，检测限制酶位点、SNP、CNV、ARK在检测上具有很好的效果，并且在临床实验室和流行病学研究中得到了广泛的应用。
在本研究中，我们使用RPA技术成功检测到一个耐药的肺结核菌株中的rpoB基因的单碱基突变。该结果表明，RPA技术在诊断肺结核中的耐药菌株方面具有很好的应用潜力。此外，应到便携式检测方法的研究和开发，使得RPA技术更加适合临床现场进行检测。
5.结论
本研究通过利用滚环扩增技术（RPA）检测了rpoB基因单碱基变异，成功地检测到了一个肺结核耐药菌株。本研究的结果表明RPA技术在结核病的治疗和预防领域具有巨大的潜力，以及实验室的敏感性和特异性。未来的工作可以将这一技术用于临床肺结核患者的检测、药物研究和结核病患者的疗效监测中。