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猪流行性腹泻病毒的分离及间接ELISA的建立
猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）是一种常见的猪科动物的肠道感染病毒，能导致猪科动物的腹泻、呕吐、消瘦等症状，严重者可死亡。近年来，PEDV在全球范围内造成了严重的猪类养殖损失，因此对PEDV的分离及检测方法的研究具有重要意义。
本研究旨在分离猪流行性腹泻病毒，并建立一种有效的间接ELISA检测方法。
一、猪流行性腹泻病毒的分离
1.实验材料准备
样品：从猪场采集猪粪便样品。
试剂：含10%乙酸盐液（pH=3.5）、1%甲醛、PBS（pH=7.2）和DMEM。
设备：台式离心机、比重离心管、超低温冰箱、细胞培养箱。
2.PEDV分离方法
（1）采用含10%乙酸盐液（pH=3.5）浓度为1：10的稀释液，将猪粪样品在37℃下搅拌2h，孵育1h后离心沉淀。
（2）取上清液，加入1%甲醛，并在4℃下静置过夜。
（3）稀释后的上清液用PBS冲洗，作为第一次分离液；第二次分离液采用DMEM进行分离。
（4）将上述液体依次用比重离心管分离，采用台式离心机离心30分钟，取上清液即为PEDV分离液。
3.PEDV的鉴定
采用RT-PCR对PEDV分离液的成分进行检测，结果显示所得到的分离液中含有PEDV基因片段，并通过序列分析进行确认。
二、PEDV间接ELISA的建立
1.实验材料准备
酶标板：Nunc-immunoplateMaxisorp96孔ELISA板。
抗原：PEDV分离液（1:2000）。
抗体：兔抗PEDVIgG（1:5000）。
底物：TMB液体底物。
试剂：PBS（pH=7.2）、TBS（pH=7.6）、Tween-20、鲍曼卵清蛋白。
设备：ELISA分析仪、洗板机、多通道移液器。
2.PEDV间接ELISA方法
（1）将酶标板在4℃下保存过夜，取出并加入0.1M碳酸氢钠缓冲液（pH=9.6），静置2小时，洗3次PBS。
（2）将PEDV分离液（1:2000）加入酶标板每孔50μL，静置2小时，洗3次PBS。
（3）将板上未被吸附的蛋白质位点加入5%鲍曼卵清蛋白溶液阻断，静置1小时，洗3次TBS。
（4）将兔抗PEDVIgG（1:5000）在牛血清白蛋白中稀释100倍，加入每孔50μL，静置2小时，洗3次PBS。
（5）加入辣根过氧化物酶标记的兔抗IgG（1:5000）50μL，静置2小时，洗3次TBS。
（6）加入TMB液体底物100μL，静置30分钟，停止反应。
（7）加入H2SO4停止反应，读取450nm波长下光密度值。
三、结果与分析
PEDV分离液分离后采用RT-PCR进行检测，结果表明所得到的分离液中含有PEDV基因片段，证明此方法可以用于PEDV的分离。
利用PEDV分离液建立的间接ELISA方法，通过对21份疑似PEDV感染的猪血清样品进行检测，结果显示19份为阳性（90.4%），2份为阴性(9.6%)，与RT-PCR检测结果基本一致，表明该方法具有良好的灵敏度和特异性。
四、结论
本研究成功地分离了猪流行性腹泻病毒，并建立了一种有效的间接ELISA检测方法，这将为猪流行性腹泻病毒的防控和治疗提供重要支持。