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猪圆环病毒2型ORF2蛋白原核表达及其ELISA抗体检测方法的建立
猪圆环病毒2型（PorcineCircovirusType2,PCV2）是一种病徐性病毒，能够引起猪只的感染。近年来，PCV2病毒引起的疾病已经成为全球猪业的一大挑战，给猪业生产和动物健康造成极大的威胁。为了更好地控制此病毒的传播，开展相关的疫苗研发和临床治疗等工作，研究PCV2病毒的结构、功能和抗原性等方面非常有必要。本文将介绍一种建立猪圆环病毒2型ORF2蛋白原核表达及其ELISA抗体检测方法。
1.材料与方法
1.1材料
编码PCV2ORF2基因的质粒pET28a-ORF2及PCV2基因组DNA；BL21（DE3）感受态细胞，NcoI、XhoI、T4DNA连接酶等实验试剂。
1.2方法
1.2.1构建表达载体
首先，将编码PCV2ORF2基因的质粒pET28a-ORF2通过NcoI与XhoI酶切，并通过T4DNA连接酶连接，得到重组的表达载体pET28a-ORF2。
1.2.2蛋白表达
将构建好的pET28a-ORF2载体转化入BL21(DE3)感受态细胞中，进行蛋白表达。表达前应先确定感受细胞的浓度，应根据菌液OD600值调整其将至0.5，转化融合质粒后在100ug/mL的苏拉暴E盘上筛选出阳性单克隆菌株，并挑取该菌株进行50ml的肉汤培养基（LB）培养14-16小时，将这部分培养基与大规模培养基的物质转移去。同时应在表达和未表达条件下对感受态菌细胞进行纯合、杂合等鉴定。
1.2.3纯化蛋白
将获得的表达菌株移植至1LLB培养基中，在OD600值为0.6时加入0.5mMIPTG进行诱导，4小时后，将菌浆收集，经过超音波破裂以裂解菌体，在离心后使用Nickel原金属亲和层析纯化蛋白。
1.2.4ELISA抗体检测
将NationalVeterinaryServicesLaboratories（NVSL）提供的抗PCV2培养上清比浓度为1:1000进行ELISA。在ELISA的96孔板中，预涂特异性的PCV2抗体，加入稀释后的蛋白液，反应一段时间后加入一定比例的二抗进行温度较低的孵育。孵育完后用适当的显色剂检测样品的相关活性即可。
2.结果与分析
2.1构建表达载体
对照pET28a质粒与我们转化的重组载体pET28a-ORF2通过双酶切仔细比对（非重组对照背景黑色），可以看到目标基因ORF2在重组载体中得到了成功集成。
2.2蛋白表达
通过对表达菌株的Screen，挑选出阳性克隆，得到较好的蛋白表达效果。
2.3纯化蛋白
经过Nickel原金属亲和层析等操作纯化得到了蛋白质。
2.4ELISA抗体检测
通过建立PCV2ORF2蛋白的ELISA抗体检测方法，所得研究结果表明，该方法具有较好的检测灵敏度和特异性，能够有效检测猪圆环病毒2型ORF2蛋白，并具有重要的应用价值。
3.结论
本文建立了一种猪圆环病毒2型ORF2蛋白原核表达及其ELISA抗体检测方法，采用此方法可获得足量纯化的PCV2ORF2蛋白，具有很好的应用价值。该方法能够为猪圆环病毒2型相关疾病的早期诊断和预防提供有力的技术支持，对于控制和治疗猪圆环病毒2型疾病有着重要的意义。