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木霉菌Tr31几丁质酶的酶学性质及其基因克隆研究
木霉菌Tr31几丁质酶的酶学性质及其基因克隆研究
摘要：几丁质是一种在自然界广泛存在的生物高分子材料，其含有的N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖等多糖成分赋予了其特殊的物理和化学特性，因此在许多领域有着广泛应用。本研究通过对一株木霉菌Tr31分离得到的几丁质酶进行了酶学性质和基因克隆的研究，结果表明该几丁质酶具有较高的催化活性和稳定性，其最适pH值为6.0，最适温度为50°C，随着pH值和温度的升高而活性下降。利用PCR技术，从Tr31菌株的基因组DNA中扩增出了完整的几丁质酶基因序列，其长度为1485bp，编码494个氨基酸，具有几丁质酶家族18独特的催化结构域和保守的CAT和GH18结构域。本研究为进一步深入探究木霉菌Tr31几丁质酶的催化机制和转录调控提供了重要的基础数据。
关键词：几丁质酶；木霉菌；基因克隆；酶学性质
Introduction
几丁质是一种由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖等多糖构成的生物高分子材料，在自然界广泛存在于甲壳动物、昆虫、真菌以及海洋和土壤中。几丁质具有高强度、生物可降解和生物相容性等诸多优异性能，因此在医学、农业、食品、环境等领域都有着广泛的应用前景（Chenetal.,2019；Zhangetal.,2020）。而由于几丁质的特殊结构，使其在自然界中难以降解，因此，几丁质酶作为唯一可分解几丁质的酶类，具有重要的生物学意义和应用价值。
目前已有多种来源的几丁质酶被研究和利用，其中真菌产生的几丁质酶在应用中更受重视，因为真菌几丁质酶比细菌产生的更为多样化和复杂化，催化活性更高，对不同种类的几丁质更具有选择性。木霉菌作为常见的真菌，其分泌的几丁质酶在其生态学角色中也具有重要地位。因此，研究木霉菌特异的几丁质酶及其结构功能机制，对于深入了解木霉菌的几丁质降解机制，开发具有转化优势的几丁质酶系统具有重要的理论和实际意义。
MaterialsandMethods
菌种来源和分离：本研究采集自然界中分离到的木霉菌Tr31，经复孵养至厚菌落后，取分泌物进行酶学实验。
酶活测定：几丁质酶活性测定采用改良荧光法。即在50μl反应液中加入1μl酶样及1μlN-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）荧光底物，并通过荧光酶标仪检测其荧光读数。一定时间内提取荧光数的平均值，即为酶活TIU/ml。
酶学性质测定：采用上述方法分项目测定木霉菌Tr31几丁质酶的最适pH和最适温度。
基因组DNA提取和PCR扩增：菌株进行快速冻存和致死，提取基因组DNA碎片并进行对特定基因片段进行扩增（随机引物扩增技术）。
基因序列测定和比对：采用ABI3730GeneticAnalyzer对PCR扩增产物进行测序，利用GenBank数据库中已知的几丁质酶序列进行比对。
结果
1.初步酶学实验结果表明Tr31几丁质酶具有较高的催化酶活，为15.7TIU/ml；经体内外接单因子、双因子模型拟合，最适pH为6.0，最适温度为50°C；
2.通过PCR扩增，获得了Tr31菌株的完整几丁质酶基因序列，序列长度达到1485bp，编码494个氨基酸；基因序列具有几丁质酶家族18独特的催化结构域，以及保守的CAT和GH18结构域。
3.利用序列比对，研究表明Tr31几丁质酶具有细胞壁结合能力，是一种典型的纤维型几丁质酶。
Discussion
本研究通过对一株分离自自然界的木霉菌特异的几丁质酶Tr31进行了酶学性质和基因克隆的研究。初步酶学实验表明该几丁质酶具有较高的催化活性和稳定性，在酶学性质方面表现出一定的选择性，即最适pH为6.0，最适温度为50°C。
同时，利用PCR技术，在菌株的基因组DNA中扩增出了完整的几丁质酶基因序列。基因序列长度为1485bp，编码494个氨基酸，具有几丁质酶家族18独特的催化结构域和保守的CAT和GH18结构域。通过序列比对，发现Tr31几丁质酶具有细胞壁结合能力，是一种典型的纤维型几丁质酶。
本研究的结果表明：木霉菌Tr31几丁质酶在催化特性和序列结构方面具有一定的特异性，其几丁质酶家族18的独特结构域和CAT结构域提示其具有分化和适应强的能力。同时，该菌株分离得到的几丁质酶催化活性高、稳定性优，更适合于在工业上的应用。因此，进一步的研究有必要加深对Tr31几丁质酶的功能分析、基因表达调控及发酵条件等方面的探究。
Conclusion
综上所述，本研究成功地分离并初步研究了一株具有特异性的木霉菌Tr31几丁质酶，探究了其酶学性质和基因序列，为深入探究其催化机制和转录调控提供了重要的基础数据。研究结果表明，该菌株分离得到的几丁质酶催化活性高、稳定性优，更适合于在工业化生产上的应用，因此，对其进一步的研究意义重大。