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根癌农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的初步研究
摘要
本文利用农杆菌介导技术对大豆子叶节进行遗传转化，以根癌农杆菌GV3101介导质粒pCAMBIA1301为载体，选择半乳糖苷酶基因（GUS）作为标记基因，建立了稳定的转化系统。通过PCR和Southernblot分析证实了目的基因已成功整合到大豆基因组中。本研究为大豆遗传转化提供了一种有效、稳定的方法，并为后续研究提供了重要的基础。
关键词：大豆、农杆菌介导、遗传转化、半乳糖苷酶基因、标记基因
Abstract
Inthisstudy,weusedAgrobacterium-mediatedtransformationtogeneticallytransformsoybeancotyledonarynodes,withtheAgrobacteriumstrainGV3101carryingtheplasmidpCAMBIA1301andselectingβ-glucuronidasegene(GUS)asthemarkergene.TheestablishmentofastabletransformationsystemwasconfirmedbyPCRandSouthernblotanalysis.Theresultsdemonstratedthatthetargetgenewassuccessfullyintegratedintothesoybeangenome.Thisstudyprovidesaneffective,stablemethodforsoybeangenetictransformation,whichcouldserveasanimportantfoundationforsubsequentstudies.
Keywords:soybean,Agrobacterium-mediated,genetictransformation,β-glucuronidasegene,markergene
引言
大豆（Glycinemax）是世界上重要的经济作物之一，其产值及经济效益都非常突出。然而，大豆种子蛋白质含量低，种子产量不高，遗传育种进展缓慢，影响了大豆生产的发展。因此，对大豆进行基因改良，提高其产量和品质，是非常必要的。
遗传转化技术是在遗传水平上实现对基因信息进行精确操作的一种方法。农杆菌介导转化是目前最常用的遗传转化技术之一。该技术通过将外源DNA插入到植物细胞的染色体中，实现目的基因在植物中的表达。由于大豆的细胞壁比较坚硬，导致遗传转化效率较低。但是，在实践中，使用根癌农杆菌进行转化，能够提高转化效率，并且能够转化各种类型的大豆组织，如子叶、愈伤组织等。因此，本研究采用根癌农杆菌介导技术，对大豆子叶节进行遗传转化。
材料与方法
材料
大豆子叶节；GV3101株；pCAMBIA1301质粒；根癌农杆菌马铃薯病原型菌株C58。
方法
1.构建pCAMBIA1301质粒
在pCAMBIA1301质粒中，插入半乳糖苷酶基因（GUS）和35S启动子，在该质粒中的GUS基因是选择性标记基因。
2.细胞培养和菌株感受性测试
对GV3101菌株进行生长适应性试验，然后将其分别生长于液态和固态的LuriaBroth培养基中，培养24小时至稳定生长状态。通过OD600测试液体培养基和比较固体培养基浓度，以检测菌株的感受性。
3.细胞转化和筛选
将大豆子叶节分别在含洋菜胶的MS培养基和LB培养基的混合液中预处理，然后采用感染液（OD600=0.6）共接种2天，转化24小时时G418筛选。设置不同的G418浓度，以筛选出真正的转化植株。
4.DNA分离、PCR和Southernblot
从筛选的转基因植物中提取DNA，并进行PCR扩增和Southernblot分析，以检测目的基因是否已整合到大豆基因组中。
结果
1.GV3101菌株均达到了生长适应性，指标显着。固态LB和液态LB培养基中的细菌菌培养基浓度为0.6-0.8，表明菌株敏感性良好。
2.通过PCR扩增和Southernblot分析，证实了目的基因已成功整合到大豆基因组中。
3.经尝试后发现，在G418浓度为10mg/L下，筛选出了真正的转化植株。
讨论
本研究利用根癌农杆菌介导技术进行大豆子叶节遗传转化，成功构建了稳定的遗传转化系统。结果表明，外源基因可以被整合到大豆基因组中，并表达出GUS基因的特征。通过筛选，成功获得了转化植株，并成功将目的基因在大豆中表达出来。
虽然本研究取得了较好的初步结果，但目前还有一些问题需要解决。首先是遗传转化效率较低，研究需要进一步优化技术，提高转化效率。其次，使用大豆的子叶节进行遗传转化仍需进一步验证，以了解转化后的大豆植株的表型性状和生长发育。
结论
本研究中，我们使用根癌农杆菌介导技