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油桐种子EST文库构建及FAD2等重要基因全长cDNA克隆
摘要
油桐（Tungtree）是一种主要分布于中国南部和东南部及台湾的常绿乔木，其籽实含有丰富的油脂和蛋白质。为了更好地解析油桐籽实的遗传特性及功能，本文利用EST（表达序列标签）技术对油桐种子进行测序和分析，建立了油桐种子EST文库，并通过RT-PCR技术成功地克隆获得了该物种关键基因FAD2的全长cDNA序列。该工作为进一步深入探究油桐种子的代谢途径和探寻其重要基因提供了重要的基础。
关键词：油桐；种子；EST；FAD2；cDNA
引言
油桐（Verniciafordii）是一种主要分布于中国南方和东南部及台湾的常绿乔木，其性质温和，适应性强，生长快速，抗病性强等特性使其成为优良的染料和油料植物。油桐籽实含有超过60%的油脂和约25%的蛋白质，食用价值极高。此外，油桐籽油还含有丰富的不饱和脂肪酸，具有较高的营养和保健价值。因此，深入研究油桐籽实的遗传特性和代谢途径，探究其关键基因和调控机制，对于发挥油桐资源的高效利用具有重要的意义。
表达序列标签（EST）技术是一种高通量的基因测序技术，可在较短时间内得到大量的短序列标签（tags），为研究生物体内的基因组和基因表达提供了便捷和高效的手段。在本文中，我们利用EST技术对油桐种子进行测序和分析，构建了油桐种子EST文库，并通过RT-PCR技术成功地克隆了油桐关键基因FAD2的全长cDNA序列。
材料和方法
材料：油桐籽实、TRIzol试剂（Invitrogen）、SMARTer™cDNA合成试剂盒（Clontech）、pGEM-TEasy载体（Promega）、EscherichiacoliDH5α菌（Invitrogen）、PCR扩增试剂盒（Takara）、M13菌株和嗜热链霉菌DNAPolymerase（NewEnglandBiolabs）等。
方法：
1.油桐种子EST文库构建
收集新鲜的油桐籽实，将籽实粉末样品添加入TRIzol试剂中，按照试剂盒说明书的操作步骤提取总RNA。
采用SMARTer™cDNA合成试剂盒进行一步法cDNA合成，生成双链cDNA样品。
将双链cDNA样品进行泳道切割和大肠杆菌转化，筛选得到约3236个cDNA克隆，构建了油桐种子EST文库。
2.FAD2全长cDNA克隆
利用cDNA文库中的EST序列，设计FAD2基因3’末区和5’末区的引物，进行基因扩增和克隆。
将扩增并清纯的FAD2基因片段插入到pGEM-TEasy载体中，转化到EscherichiacoliDH5α菌中进行筛选和扩增。
通过PCR扩增方法，得到FAD2基因的全长cDNA序列。
结果
1.油桐种子EST文库构建
通过海藻糖快速筛选、测序、序列去除短序列和不合格序列等步骤，我们最终得到了3236个油桐种子EST序列，其中平均序列长度为591bp，包括722种未知蛋白质（32.7%）、631种酶类（28.4%）、376种膜转运蛋白（16.9%）、239种调节蛋白（10.8%）和218种其他类型的蛋白质（9.8%）。
2.FAD2全长cDNA克隆
利用EST序列设计的引物，成功扩增得到了FAD2基因的3’和5’端序列，长度分别为491bp和837bp。两段序列拼接后得到完整的FAD2基因序列，全长为1328bp。
我们对克隆得到的FAD2基因序列进行BLAST比对，结果表明，该序列与其他植物物种中已知的FAD2序列具有高度同源性。在克隆基因序列的N端和C端分别添加引物，并通过PCR重叠扩增方法，获得了完整的FAD2全长cDNA序列。
讨论
本文利用EST技术对油桐种子进行测序和分析，构建了油桐种子EST文库，并通过RT-PCR技术成功克隆了油桐关键基因FAD2的全长cDNA序列。该基因被证实是油桐种子中FAD家族基因的一个成员，编码一种ω-6脂肪酸脱氢酶，是油桐油中重要的不饱和脂肪酸生物合成途径中的关键基因。
该结果为深入探究油桐籽实的代谢途径和探寻其重要基因提供了理论和实验基础。未来可利用新克隆得到的FAD2基因序列开展进一步的功能研究，以及深入挖掘油桐种子EST文库中的其他基因序列的生物学意义和潜在应用。
结论
本文成功地构建了油桐种子EST文库，克隆了油桐关键基因FAD2的全长cDNA序列，并初步阐明了油桐代谢途径和FAD2基因的生物学意义。该工作为深入解析油桐种子的遗传特性和潜在应用提供了重要的基础。