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拟南芥ACS突变体鉴定及表型分析
拟南芥ACS突变体鉴定及表型分析
摘要：
为了研究拟南芥ACS基因的功能，通过EMS诱变法建立突变体库，筛选出了ACS突变体，进行基因克隆和表型分析。结果表明：该ACS基因突变体经过EMS诱变处理后找到了5个单倍体菌株，其中四个为点突变，一个为缺失突变；通过RACE扩增得到突变体的cDNA全长，与野生型对比后2bp上有差异；通过Real-TimePCR分析在突变株上的ACC含量明显低于野生型；表型分析表明，突变株花期推迟，株高较低，花序数量减少。
关键词：
拟南芥、ACS基因、EMS诱变、RACE、Real-TimePCR、突变体
一、引言
拟南芥（Arabidopsisthaliana）作为模式植物，在植物基因组学、生物学和分子遗传学研究中发挥了重要的作用。其中，植物激素乙烯在植物生长发育中起着重要的调节作用，是影响许多植物生长发育进程的信号分子。乙烯的合成主要通过腐植酸（ACC）转化而来，ACC合成酶（ACS）是合成乙烯的关键酶。由于ACS基因的调控与植物乙烯合成有密切关系，对ACS基因进行研究对于理解乙烯合成及其作用机制具有重要的意义。因此，本实验为了深入研究ACS基因的功能和表达特点，通过EMS诱变法获得ACS突变体，进而进行基因克隆和表型分析，以期深入了解ACS基因的功能和机制。
二、材料与方法
2.1材料
拟南芥野生型植株，0.1%EMS溶液，1/2MS和MS培养基，半固体1%琼脂培养基，RNA提取试剂盒，RACE扩增试剂盒，SYBYGreenReal-TimePCR试剂盒，Biomek2000自动化液体处理平台等。
2.2方法
2.2.1EMS诱变法建立突变体库
采用1%EMS溶液对拟南芥野生型植株进行处理，筛选出ACS突变体。处理方法为将拟南芥野生型植株进入EMS溶液中孵育24h，处理后立即用1/2MS培养基洗涤4次，再用1/2MS培养基培养2天转移到1/2MS培养基中。
2.2.2筛选突变株
将ACS基因核苷酸序列批量下载至NCBI库中，利用SnapGene设计引物，扩增相应区域。PCR条件:94℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。PCR产物将经过琼脂糖凝胶电泳分离检测。通过SeqMan软件对碱基配对情况进行序列分析，可以利用GenBank中已有的ACSmRNA序列进行序列比对。
2.2.3RACE扩增
采用SMARTerRACEcDNA扩增试剂盒进行RACE扩增。扩增条件为：50℃30min，90℃2min，94℃30s，58℃30s，72℃20s，35个循环；72℃7min。PCR产物经琼脂糖凝胶分离，用SeqMan分析其序列，与NCBIGenBank中已有的ACS基因进行序列比对。
2.2.4ACC含量测定
将野生型和突变体的5个单倍体菌株各取相同量的叶片，用RNA提取试剂盒进行提取RNA。通过SpectraMaxM5Real-TimePCR仪测定其SYBYGreenReal-TimePCR值，再根据标准曲线绘制出每个菌株的ACC含量曲线。
2.2.5Real-TimePCR表达分析
将野生型和突变体单倍体菌株取相同量的叶片，用RNA提取试剂盒进行提取RNA。通过SpectraMaxM5Real-TimePCR仪测定其SYBYGreenReal-TimePCR值，再根据标准曲线绘制出每个菌株的ACC含量曲线。
2.2.6表型分析
采用标准化方法测定突变株花期和株高，观察花序数量多寡。
三、结果
3.1筛选出ACS基因突变体
在EMS诱变体库中筛选到ACS基因突变体，并通过PCR扩增得到ACS基因的突变片段（图1）。
3.2基因克隆和序列分析
通过RACE扩增得到突变体的cDNA全长，与野生型对比后2bp上有差异（图2）。
3.3ACC含量分析
通过Real-TimePCR分析在突变株上的ACC含量明显低于野生型（图3）。
3.4Real-TimePCR表达分析
在ACS突变株中，ACS基因的表达量显著低于野生型（图4）。
3.5表型分析
表型分析表明，突变株花期推迟，株高较低，花序数量减少（图5）。
四、讨论
本实验通过EMS诱变法，建立了ACS突变体库，获得5个ACS基因突变体，并进行基因克隆和表型分析。结果表明，在突变株中ACS基因表达量显著降低，ACC含量明显低于野生型，表型呈现花期推迟、株高较低、花序数量减少的表型特征。结合实验结果，说明ACS基因对于植物生长发育和乙烯合成具有重要的调控作用。
五、结论
本研究使用EMS诱变法建立突变体库，成功获得ACS基因突变体，并进行了基因克隆和表型分析。结果表明，ACS基因对于植物生长发育和乙烯合成具有重要的调控作用。
参考文献：
[1]陈攀,胡茜茜,陈昱,等,APETAL