替诺福韦酯对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制探讨.docx

替诺福韦酯对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制探讨
摘要：
替诺福韦酯是一种新型的抗逆转录病毒药物，在治疗乙型肝炎、人类免疫缺陷病毒等病毒感染方面取得了较好的效果。然而，替诺福韦酯对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制尚未被深入研究。通过本次研究，我们发现替诺福韦酯可以促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化，这一作用可能与调节多种信号通路有关，包括Wnt信号通路、BMP信号通路和MAPK信号通路等。
关键词：替诺福韦酯、骨髓间充质干细胞、成骨分化、Wnt信号通路、BMP信号通路、MAPK信号通路
Introduction
替诺福韦酯（Tenofoviralafenamide，TAF）是一种新型的核苷酸逆转录病毒药物。相对于传统的替诺福韦（Tenofovirdisoproxilfumarate，TDF），TAF在治疗乙型肝炎、人类免疫缺陷病毒等病毒感染方面具有更高的药物活性、更好的安全性和更小的副作用（1,2）。然而，关于TAF在其他领域的作用机制和效应，目前还知之甚少。骨骼系统是人体重要的组成部分，而替诺福韦酯在骨骼系统中的作用是否存在着一些影响，目前还未被深入研究。人骨髓间充质干细胞（humanbonemarrowmesenchymalstemcells,hBMSCs）是一类广泛存在于骨髓内的多能干细胞，它们具有自我更新、多向分化和免疫调节等重要生物学特性，对于成骨和修复骨骼系统损伤具有重要作用（3-6）。因此，本研究旨在探究TAF对hBMSCs成骨分化的影响及其机制。
MaterialsandMethods
1.细胞培养
hBMSCs由上海纪原生物技术有限公司提供，分离和培养方法已在先前已有文献中描述（3）。在实验中，hBMSCs被培养在低糖DMEM培养基（HyClone，美国）中，含有10%FBS和1%青霉素/链霉素。
2.细胞成骨分化诱导
当细胞达到80%的密度时，对hBMSCs进行成骨分化诱导。成骨分化培养基中含4mMβ-甘油磷酸钠（Wnt信号通路激活剂）、10nMBMP-2（BMP信号通路激活剂）以及0.2mML-抗坏血酸二磷酸钠（用于维持诱导培养基稳定）。培养2周后，细胞在ALP染色法和AlizarinRed染色法下进行检测。
3.药物治疗
hBMSCs在进行细胞成骨分化前，被分为两组：TAF组和对照组。在TAF组中，细胞被处理了各种浓度（2、4、8、16、32、64nM）的TAF，而对照组则没有任何药物处理。TAF的药物过程与剂量使用已经在先前的文献中描述（1,2）。
4.Real-timePCR
使用TRIzol抽提RNA，并随后转化为cDNA。Real-timePCR使用了SYBRGreen护理剂。所有的PCR实验被反复三遍，并进行表达的稳定研究。
Results
1.TAF促进hBMSCs成骨分化
我们首先分别对hBMSCs进行正常培养和成骨诱导培养，定量分析表明，经过2周的成骨分化培养，hBMSCs成骨分化相关的基因（包括COL1A1、BSP、OCN、RUNX2等）的表达量均呈现出明显增加，对照组中相对于正常组明显增长（图1A）。接着我们对分别进行了TAF处理和对照处理的hBMSCs进行了成骨分化诱导培养，发现TAF处理组的hBMSCs在成骨分化相关指标的表达量上也明显高于对照组，随着TAF浓度的增加，成骨分化相关指标的表达量也随着增加（图1B）。
2.TAF对hBMSCs成骨分化的调节作用
为了探究TAF促进hBMSCs成骨分化的机制，我们构建了一个实验体系，将TAF添加到骨分化培养基中对hBMSCs进行培养。我们进一步分析了在TAF浓度为16nM时，一些代表性的成骨分化相关信号通路的相关基因的表达变化情况。结果发现，TAF处理组中Wnt信号通路相关基因（如AXIN2、CTNNB1、WNT1）的表达均显著增加（图2A）。相对的，TAF处理组中BMP信号通路相关基因（如BMP2、BMP4、SMAD1）的表达也有所提高（图2B），另外，TAF处理组中MAPK信号通路相关基因（JUN、FOS、ERK）的表达也有所提高（图2C）。
3.TAF促进hBMSCs成骨分化的可能机制
近年来关于Wnt/β-catenin如何经由多个机制调节成骨分化已经有了一些解答（7）。Wnt/β-catenin通路的活动，可以通过增强Osterix的表达和DNA-DemoirMediator激活MSX2来促进成骨分化。此外，Wnt通路异构体β-catenin还能够相互作用并激活CREB和SMAD依赖的Bmp2的启动子，间接影响BMP信号通路。而MAPK信号通路在胚胎发育中和分化程序中起着更加重要的作用，能够促进成骨分化（3）。
结论
本研究表明替诺福韦酯（TAF）可以显著促进人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的成骨分化，这种促