Ⅱ型胶原荷载成髓核细胞分化的脂肪间充质干细胞修复椎间盘退变的体内外研究的任务书.docx

Ⅱ型胶原荷载成髓核细胞分化的脂肪间充质干细胞修复椎间盘退变的体内外研究的任务书
一、研究背景与意义
椎间盘是脊柱的重要组成部分，主要起着支撑作用和缓冲作用。随着人口老龄化和生活方式的改变，椎间盘退变逐渐成为影响人们生活质量的一种常见疾病。目前，椎间盘退变的治疗方法主要有onservativetherapy、手术治疗和生物治疗。相比于传统治疗，生物治疗具有无创、低风险、恢复快等优点。而干细胞治疗作为生物治疗的核心，已经成为椎间盘退变的治疗热点。
近年来，脂肪间充质干细胞（Adipose-derivedmesenchymalstemcells，ADSCs）作为一种具有成体干细胞特性的多能干细胞，由于来源充足、提取方便、维持扩增性能稳定等优点，已被广泛应用于多种疾病的治疗。但在应用上，存在许多问题，如生物学特性、成纤维样变可能性等都存在争议。其中，ADSCs从骨髓或脂肪中分离出来的形态和功能不稳定，因此有必要通过改变其生物表达方式来提高其细胞命运掌控能力。
成髓核细胞是包括多种不同分化程度的细胞类群，其中高度分化的成髓核细胞可以作为椎间盘细胞来源。Ⅱ型胶原是椎间盘组织中重要的成分，也是成髓核细胞重要的分泌物。因此，将Ⅱ型胶原蛋白作为载体，将ADSCs趋向成为髓核细胞，可能是一种应试探的思路。此外，脂肪干细胞得以直接向颈椎、腰骶椎的椎间盘转移，即选取Ⅱ型胶原作为载体的方式和分化方式都方便直观，在临床应用领域有广泛潜力。
因此，本研究旨在通过将Ⅱ型胶原作为载体，通过ADSCs的分化成为髓核细胞，探究其修复椎间盘退变的生物学机制。
二、研究内容和方案
1.ADSCs的来源与分离
选取成年健康雄性患者腹部脂肪组织作为ADSCs的来源。采用胰蛋白酶消化法将脂肪组织分解，经过贴壁培养、筛选和扩增后，获得足够的ADSCs。
2.Ⅱ型胶原的构建与载体处理
采用基因工程技术构建Ⅱ型胶原表达载体，并在载体中添加慢病毒表达系统，通过PCR、Westernblotting、细胞免疫荧光及红外线成像方法验证其表达水平和功能性。
3.ADSCs分化成髓核细胞
将Ⅱ型胶原载体转染至ADSCs后、分化诱导，使用荧光原位杂交等方法检测获得的髓核细胞，刺激髓核细胞分化为成髓核细胞的程度。
4.椎间盘退变大鼠模型的构建
选择SD大鼠，将其随机分为A、B两组。A组（实验组）接受Ⅱ型胶原+ADSCs处理，而B组（对照组）则接受安慰剂治疗。将椎间盘退变诱导剂细胞生物材料注射入B组大鼠首尾椎间盘内，而A组大鼠则注射Ⅱ型胶原+ADSCs。
5.椎间盘组织学和分子学的研究
将对照组和实验组大鼠的椎间盘组织取出，经过病理学检测和生化学指标分析，检测髓核细胞的分化程度与Ⅱ型胶原的表达情况，探究其生物学机制的变化。
三、研究意义与预期结果
本研究通过Ⅱ型胶原作为载体，将ADSCs分化成髓核细胞走向，尝试探究这种方式对椎间盘退变的生物学改变，极大增加应用ADSCs集治疗椎间盘坏死，尝试为临床治疗提供可能性。
预期结果包括:
1.成功构建Ⅱ型胶原表达载体，证明其表达水平和功能性。
2.成功将ADSCs分化成髓核细胞，并检测到成髓核细胞分泌的Ⅱ型胶原蛋白在椎间盘组织修复中的功能性。
3.大鼠实验结果表明，Ⅱ型胶原+ADSCs处理显著改善椎间盘组织状态，减轻椎间盘退变的影响，与安慰剂组的对照结果有显著差异。
4.在病理学检测和生化学指标分析中，实验组与对照组大鼠的椎间盘组织存在生物学机制上的显著差异，预示着该治疗方案在治疗椎间盘退变方面具有一定的临床应用前景。
四、预期创新点和实际应用
1.选取Ⅱ型胶原作为载体，探究该种干细胞分化方法对椎间盘退变的生物学机制，从而开启应用多能干细胞治疗的可能性；
2.在病理学检测和生化学指标分析中，发现实验组与对照组大鼠椎间盘组织存在生物学机制上的显著差异，进一步表明该种治疗方案在治疗椎间盘退变上具有一定临床应用前景；
3.本研究的结果也有助于永久性退化的脊柱病变的研究。这些创新点可能会导致治疗领域的技术和认识方面的变革，深化ADSCs的临床应用，提高其技术水平。
参考文献：
1.Kagda,F.H.,&Elsayed,E.A.(2018).Mesenchymalstemcellsintreatmentofdiscdegeneration:Acasereport.InternationalJournalofSurgeryCaseReports,52,126-129.
2.CalabreseG.(2013).Regenerativemedicineinintervertebraldiscdisorders.BioMedresearchinternational,15(2013),856342.
3.Pelttari,K.,Winter,A.,Steck,E.,Go