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Net1对小鼠胚胎干细胞向中内胚层分化的影响的任务书
一、背景
胚胎干细胞（Embryonicstemcells,ESCs）具有自我更新和多能性的特点，因此被广泛用于研究生物学和药学。一种比较重要的应用是将ESCs体外分化成多种细胞类型，从而为治疗或再生医学提供源头细胞。而中内胚层（Mesoderm）是分化出多种高级别的细胞类型（如心脏和骨骼肌）的重要起始点。
Net1是一个小分子化合物，已经被证实可以促进干细胞向中内胚层的定向分化。在本次实验中，我们将继续探究Net1对小鼠胚胎干细胞向中内胚层分化的影响，以期进一步优化干细胞体外分化的方法，为再生医学提供更多有价值的细胞资源。
二、实验目的
1.确定Net1处理时间对小鼠胚胎干细胞向中内胚层分化的影响；
2.比较Net1处理前后小鼠胚胎干细胞的基因表达谱差异；
3.观察Net1处理后小鼠胚胎干细胞定向向中内胚层分化的效果；
4.分析Net1处理对小鼠胚胎干细胞自我更新和多能性的影响。
三、实验方法
1.材料准备
-小鼠胚胎干细胞（ES-D3）细胞系
-LIF无血清培养基DMEM/F12
-Net1处理溶液（含Net15μmol/L）
-差异基因表达谱芯片
-荧光染色试剂（Rhodamine123，AlkalinePhosphatase）
2.实验步骤
2.1Net1处理小鼠胚胎干细胞
-将小鼠胚胎干细胞接种在6孔板中，分别加入不同浓度的Net1处理溶液；
-处理各组细胞24h、48h和72h后，分别进行下一步实验。
2.2提取RNA并制备差异基因表达谱芯片
-用Trizol法提取小鼠胚胎干细胞总RNA，按照常规步骤进行纯化和浓缩；
-使用差异基因表达谱芯片反映小鼠胚胎干细胞在Net1处理前后的基因表达谱变化。
2.3观察小鼠胚胎干细胞的自我更新和多能性
-制作干细胞集落形成试验（CFU）文化基质（含LIF）；
-用Rhodamine123和AlkalinePhosphatase荧光染色试剂，观察Net1处理小鼠胚胎干细胞的自我更新和多能性变化。
2.4观察小鼠胚胎干细胞向中内胚层的定向分化
-玻片干燥后涂覆鲑鱼精卵清蛋白（SDS），再覆盖一层胶原质；
-在SDS胶原质体系中培养Net1处理的小鼠胚胎干细胞，观察其向中内胚层分化的程度。
四、实验预期结果
1.Net1处理时间对小鼠胚胎干细胞向中内胚层分化的影响。确定最适处理时间，为干细胞体外分化提供指导。
2.比较Net1处理前后小鼠胚胎干细胞的基因表达谱差异，了解Net1的影响机制。
3.观察Net1处理后小鼠胚胎干细胞定向向中内胚层分化的效果，验证Net1的促进作用。
4.分析Net1处理的影响，了解其对小鼠胚胎干细胞自我更新和多能性的影响，为进一步优化干细胞体外分化的方法提供参考。