pET32a-XBP1u蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备的任务书.docx

pET32a-XBP1u蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备的任务书
任务目的：
本任务旨在探究pET32a-XBP1u蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法，以实现该蛋白的高效表达、高纯度纯化和高敏感度的免疫检测。
任务内容：
1.克隆pET32a-XBP1u蛋白
(1)从人类细胞中提取XBP1u基因的cDNA。
(2)采用PCR扩增XBP1u基因，含有NdeI和XhoI限制酶切位点。
(3)将扩增产物与pET32a载体进行限制酶切和连接，构建重组质粒pET32a-XBP1u。
2.表达和纯化pET32a-XBP1u蛋白
(1)将pET32a-XBP1u重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)在含有1mMIPTG的LB培养基中诱导表达，同时添加50mg/L的kanamycin。
(3)酵母粘合酶处理后收集菌株，使用超声波破碎法破裂细胞壁，离心分离细胞裂解液。
(4)使用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白，以去除大部分非特异性蛋白。
(5)使用SDS-PAGE和Westernblot分析纯化的蛋白质。
3.制备多克隆抗体
(1)将表达和纯化的pET32a-XBP1u蛋白注射入Balb/c小鼠中，以诱导免疫反应，每两周注射一次。
(2)在提取小鼠血清后，进行ELISA筛选，选择阳性小鼠进行细胞融合。
(3)使用重组蛋白依赖的口服接种法(Eppstein-Barrvirusnull)或骨髓细胞接种法(P3x63Ag8.653)融合小鼠B细胞和骨髓瘤细胞，制备杂交瘤细胞。
(4)进行克隆选择和扩增，收集杂交瘤细胞培养上清液，制备第一次抗体。
(5)将第一次抗体与pET32a-XBP1u蛋白交联或固定，制备免疫吸附树脂。
(6)使用免疫吸附树脂亲和层析，纯化多克隆抗体。
4.鉴定多克隆抗体
(1)使用Westernblot进行鉴定。
(2)使用间接免疫荧光法(IF)或免疫组化(ICC)进行鉴定。
(3)使用ELISA比较不同批次的多克隆抗体。
任务要点：
本任务的要点主要包括：
1.pET32a-XBP1u蛋白的克隆构建与验证。
2.pET32a-XBP1u蛋白的高效表达和纯化。
3.多克隆抗体的制备方法与方案。
4.多克隆抗体的检验和鉴定方法。
任务技术路线：
本任务的技术路线主要包括：
1.大肠杆菌BL21(DE3)菌株的培养和转化。通过Luria-Bertani(LB)培养基对大肠杆菌进行培养、对含有pET32a-XBP1u质粒的大肠杆菌进行转化。
2.蛋白表达和纯化。使用IPTG诱导大肠杆菌表达pET32a-XBP1u蛋白，并使用Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白的纯化。
3.免疫样品制备。使用重组蛋白诱导小鼠免疫，并融合杂交瘤细胞，制备多克隆抗体。
4.多克隆抗体的检鉴。使用Westernblot、免疫荧光法(IF)或免疫组化(ICC)进行多克隆抗体的鉴定。