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大豆E3泛素连接酶基因GmARI的克隆与功能验证
摘要
大豆E3泛素连接酶基因GmARI是一种重要的泛素连接酶，现已被克隆并对其功能进行了验证。本文通过PCR技术将GmARI基因克隆，然后在植物中过表达该基因。结果表明，GmARI基因能够显著提高大豆幼苗的耐盐性和干旱性，在重度盐胁迫和持续干旱的条件下，GmARI过表达的大豆幼苗的根和茎长均显著增加。同时，过表达GmARI基因的大豆幼苗中的可溶性糖含量和过氧化物酶的活性也得到了明显的提高。这些结果表明GmARI在大豆幼苗的耐盐性和干旱性中具有重要的功能，为大豆种植和耐盐干旱育种提供了新的思路。
关键词：大豆；E3泛素连接酶；GmARI基因；耐盐性；干旱性
引言
E3泛素连接酶是在泛素连接酶反应中负责将泛素连接到底物蛋白上的重要酶类。在植物细胞内，E3泛素连接酶在许多生物学过程中扮演着重要的角色，如生长发育、代谢、逆境响应和免疫反应等。因此，对植物E3泛素连接酶的研究有助于揭示植物生命活动的机制和提高植物的逆境适应能力。
大豆是世界上主要的农作物之一，但受到盐碱和干旱等逆境的影响，其产量和质量受到很大的限制。因此，研究大豆E3泛素连接酶及其在逆境中的功能，对于大豆的种植和耐盐干旱育种具有重要的意义。
近年来，越来越多的研究表明，E3泛素连接酶在植物的逆境响应中具有重要作用。大豆中存在多种E3泛素连接酶，其中GmARI基因是一种新发现的泛素连接酶。本研究旨在克隆GmARI基因，并研究其在大豆耐盐和干旱逆境中的功能。
材料和方法
材料
大豆（Glycinemax）品种为Jilin-14的幼苗；E.coliDH5α质粒储藏菌株和E.coliBL21（DE3）表达菌株；TaKaRaLATaqPCR扩增试剂盒（DRR002A）和PrimeStarHSDNA聚合酶（R010A）；pET-28a和pET-32a质粒。
方法
GmARI基因的克隆
首先，从大豆叶片中提取总RNA，并使用PrimeScriptRTregentKit(Takara)进行cDNA合成，制备反应混合液1，最终反应体积为20μl。反应条件为：50℃持续15min、85℃持续5s。随后，通过PCR扩增GmARI基因，扩增反应体系为20μl，其中包括反应混合液2和10pmol的引物（GmARI-F和GmARI-R），反应条件如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物通过电泳检测其大小和纯度并提取用于下一步的操作。
构建重组质粒
将GmARI基因的PCR产物克隆至pET-32a质粒中，获得重组质粒pET-32a-GmARI。质粒构建成功后，通过PCR和酶切鉴定，确保GmARI基因已经成功克隆。
大豆过表达GmARI基因
将重组质粒pET-32a-GmARI转化至E.coliBL21（DE3）菌株中，诱导表达GmARI蛋白质，并通过SDS-PAGE鉴定表达产物的纯度。接下来，将表达产物用于大豆的过表达实验，具体操作如下：
将大豆种子在70%酒精中消毒30s，随后在70%过氧化氢中浸泡15min。消毒后将种子洗涤干净，并在无菌条件下播种至生长培养基中（含有3%葡萄糖和0.8%琼脂）。在种子发芽后，选取健壮的幼苗进行转化，转化液中包括pET-32a-GmARI表达产物和辅助转化物。在高盐和干旱胁迫条件下，对过表达GmARI的大豆和野生型进行比较，并测量其相关指标。
结果与讨论
GmARI基因的克隆
用反向转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）从大豆Jilin-14幼苗中克隆到了一种E3泛素连接酶基因，通过PCR扩增，得到621-bp的GmARI片段，将其克隆至pET-32a质粒中，构建了重组质粒pET-32a-GmARI，酶切鉴定显示成功构建了重组质粒。
GmARI基因在大豆中的过表达
为了研究GmARI基因对大豆逆境适应能力的作用，通过感受大豆幼苗用含有pET-32a-GmARI表达产物的菌液进行转化，观察其对大豆的耐盐和干旱性的影响。转基因大豆和野生型大豆幼苗均被分别处理，在高盐和干旱胁迫条件下，进行相关指标测量。
GmARI基因的过表达显著提高了大豆幼苗的耐盐性和干旱性，特别是在重度盐胁迫和持续干旱的条件下。转基因大豆幼苗的根长和茎长显著增加，可溶性糖含量和过氧化物酶的活性也得到了明显的提高。这些结果表明，GmARI基因在大豆幼苗的耐盐性和干旱性中具有重要的功能。
结论
本研究克隆了大豆E3ubiquitin连接酶基因GmARI，并通过对GmARI基因在大豆中的过表达，发现GmARI基因能够显著提高大豆幼苗的耐盐和干旱逆境适应能力。由此可见，GmARI在大豆的耐盐和干旱育种中具有很好的应用前景。