分子杂交技术.ppt

第一节分子杂交的原理
核酸分子杂交（nucleicacidhybridization）
指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。

分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链

不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的双链分子——杂交分子
若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷酸以上)，可以得到很准确的鉴定结果。但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短（如20～30个核苷酸），则难免会出现准确性差的假阳性现象。
杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。
杂交的双方：探针和要检测的核酸。
将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。

被检测的核酸：
克隆化的基因组DNA提纯的
细胞总DNA细胞内杂交（细胞原位杂交）
细胞总RNA变性

杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。一、DNA变性与复性二.分子杂交的一般程序制备DNA或RNA样品→与固定基质结合→80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交→洗涤→放射自显影或显色反应。
三、核酸探针的制备1.探针的制备方法2.探针的分类
据来源及性质不同可分为：
(1)基因组DNA探针
(2)cDNA探针
(3)RNA探针
(4)寡核苷酸探针合成寡核苷酸探针注意原则3.核酸探针的标记标记的种类第二节核酸分子杂交的方法按待测核酸是否固定在固相支持物上分：
固-液相杂交
膜上印迹杂交
原位杂交
液相杂交
RNA酶保护分析法
核酸酶S1保护分析法
一、Southern杂交步骤：
酶切DNA,凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。
(2)将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。
(3)预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。(4)让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。
(5)通过显影检查目的DNA所在的位置。
带有DNA片段的凝胶（一）待测核酸样品的制备
1、裂解或破碎细胞
2、抽取纯化基因组DNA
3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段（二）待测DNA样品的电泳分离
所用分子量标准可用核素标记，杂交后的标准分子量DNA也能显影出条带。

（三）凝胶中核酸的变性（碱变性）
分子量超过10kb的较大的DNA片段，需要很长的转移时间。必须将最长的DNA片段控制在大约2kb以下。
如果靶序列>5kb，则需进行脱嘌呤处理（DNA产生缺口将提高转移的质量）。
把凝胶浸在0.25mol/LHCl中，室温轻轻晃动，直到溴酚蓝从蓝变黄。
注意：处理人类基因组DNA≤10分钟；处理植物基因组DNA≤20分钟。
再把凝胶浸在灭菌双蒸水中如果靶序列<5kb，则直接进行下面的步骤
(1)把凝胶浸在变性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中，室温2×15分钟，轻轻晃动。
(2)把凝胶浸在灭菌双蒸水中
(3)把凝胶浸在中和液中（0.5mol/LTris-HCl，Ph7.5，1.5mol/LNaCl），室温2×15分钟。
(4)在20×SSC中平衡凝胶至少10分钟。（四）Southern印迹
高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜（尼龙膜也较长用）上，烘干固定后即可用于杂交
本方法由Southern发明,故又称为Southern转移(或印迹)（1）毛细管虹吸印迹法（2）真空转移法优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。

缺点是如不小心，会使凝胶碎裂,并且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高。（3）电转法（五）Southern杂交预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。

预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，但其中主要含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与DNA探针DNA杂交）、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交
双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交
转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针DNA，即可进行杂交反应。
杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。离子强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。
杂交过夜（至少18h）