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复制型HBV小鼠模型建立及可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠制备
引言
乙型肝炎病毒（HBV）感染是一种普遍存在的公共卫生问题，全球有超过3亿人受到影响。HBV感染后可引起急性或慢性肝炎，最终进展为肝硬化或肝癌等严重疾病。尽管世界各地已经开展了免疫预防措施，如疫苗和抗病毒治疗，但HBV仍然是一个有挑战性的公共卫生问题。
为了更好地研究HBV感染和病理生理学，必须开发适宜的动物模型。其中，HBV复制型小鼠模型是一种广泛应用的模型，它通过转基因技术将人类HBV基因重组到小鼠基因组中，从而使小鼠感染HBV，展现与人类感染相似的症状。与其他动物模型相比，HBV复制型小鼠模型更便于研究新型药物的疗效，以及对HBV感染及其病理过程的分子机制的探究。
此外，肝细胞特异性表达人尿激酶型纤维蛋白溶解酶原激活物（uPA）转基因小鼠是一种常用的动物模型，该转基因小鼠主要用于研究肝脏再生、肝损伤和肝癌的病理生理机制。这种小鼠仅在肝脏中表达uPA，它能够将单链纤维蛋白原转化为双链纤维蛋白，促进纤维蛋白的溶解，从而诱导肝内细胞的增殖和癌变。而uPA转基因小鼠感染HBV后，在其肝脏中表达的uPA可以有效地加速HBV的繁殖和感染严重程度，从而更好地模拟真实的肝癌进展过程。
因此，本文旨在介绍一个同时具有HBV复制型和uPA转基因特性的小鼠模型，以探究HBV感染和肝癌发展的病理生理学机制，并且提供反映人类疾病病理生理的模型。
材料和方法
制备复制型HBV转基因小鼠模型
复制型HBV转基因小鼠模型制备采用标准酶切和克隆技术，在BALB/c小鼠的基因组中重组HBV基因。HBVC基因编码区和酶切位点Kpnl-K-pnl中复制序列被克隆在pBS/U6sh/uPA引物在约7Kpnl位点上的酶切位点之间。随后，将pBS/U6sh/uPA和C基因在7Kpnl和KpnlⅠ之间的插入体定向连接在一起，构成扣除Kpnl中的r2位点的HBV转基因模型。
制备uPA转基因小鼠
uPA转基因小鼠模型制备方法是将人uPA基因定向缺失（离子吸附层析分离或化学变性制剂辅助）连接到细胞特异性表达肝脏合成酶前肝细胞特异性表达的基因增强剂，构建一个肝细胞特异性表达人uPA的模型。使用单克隆抗体通过ELISA和Westernblot验证uPA的表达。通过RT-PCR检测基因表达对肝脏和其他组织的影响，以及各转基因小鼠的易感性比较和表现。
感染复制型HBV转基因和uPA转基因小鼠
将复制型HBV转基因和uPA转基因小鼠感染HBV。在培养的HUH7.5.1细胞中提取HBV病毒粒子，并通过尾静脉注射的方式将其注入到小鼠体内。采用适当的方法和工具，检测小鼠血清中HBV-DNA含量的变化，分析转基因小鼠的HBV感染症状和HBV复制的机制。
结果
HBV复制型小鼠模型和uPA转基因小鼠模型的构建成功，肝脏中的uPA表达明显高于其他组织。采用尾静脉注射的方式将HBV注入复制型HBV转基因小鼠模型和uPA转基因小鼠模型，成功建立同时具有HBV复制型和uPA转基因特性的小鼠模型。
通过PCR检测和分析转基因小鼠的基因表达，发现在复制型HBV转基因小鼠模型中，HBV复制效率较高，而在uPA转基因小鼠模型中，肝脏中的uPA高表达降低了小鼠的生存率。
进一步对复制型HBV转基因小鼠模型和uPA转基因小鼠模型的肝脏进行病理学分析，发现复制型HBV转基因小鼠模型中的肝细胞坏死和肝细胞增殖明显比uPA转基因小鼠模型高。此外，复制型HBV转基因小鼠模型的肝脏中有更多的病毒颗粒和DNA。
讨论
本研究成功地构建了同时具有HBV复制型和uPA转基因特性的小鼠模型。该模型可用于研究HBV感染、病毒复制和病理发展的分子机制。此外，uPA转基因小鼠可用于研究肝癌的发生和发展，肝细胞增殖和损伤等病理生理机制。
对于HBV感染研究，这一新的动物模型不仅可模拟人类肝炎病毒感染的发展，而且可细化病毒复制的机制和病理发展途径。通过在模型中加入uPA基因，同时可以加速HBV的病理发展，有助于研究肝癌的发生和发展。因此，本研究的新型动物模型为HBV感染和其病理生理学机制提供了有利的研究工具。
结论
本研究构建了同时具有HBV复制型和uPA转基因特性的小鼠模型，这一模型可用于研究HBV感染及其病理生理学机制，并提供反映人类疾病病理生理的模型。