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DNA浓度和纯度的测定
一、原理
DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处.波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。
对标准样品来说，浓度为1μg/ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02
当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg/ml
ssDNA浓度约为37μg/ml
RNA浓度约为40μg/ml
寡核苷酸浓度约为30μg/ml（youyu底物不同有差异）
当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定.一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。
经验值：
纯DNA:OD260/OD280≈1。8（＞1.9,表明有RNA污染；＜1。6,表明有蛋白质、酚等污染）
纯RNA:1。7＜OD260/OD280＜2.0（＜1。7时表明有蛋白质或酚污染；＞2。0时表明可能有异硫氰酸残存)
若样品不纯，则比值发生变化,此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用方案二的方法或其他方法进行估算.
二、材料、试剂及器具
1、材料
提取的PUC19样品、PUC19标准样品
2、试剂
灭菌重蒸水，TE缓冲液
3、器皿
石英比色皿；UV—240紫外分光光度计
二、实验步骤
1、UV—240紫外分光光度计开机预热10min。
2、用重蒸水洗涤石英比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。
3、设定狭缝后校零.
4、将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记录编号和稀释度。
5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。
6、设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值.
7、计算待测样品的浓度与纯度。
DNA样品的浓度（μg/μl):OD260×稀释倍数×50/1000
RNA样品的浓度(μg/μl)：OD260×稀释倍数×40/1000

方案二溴化乙锭法
一、原理
溴化乙锭（EB）是一种嵌入型染料，其上的一个扁平的基团可插入到DNA或RNA链的堆积碱基之间。溴化乙锭的嵌入基团与碱基的接近使二者紧密结合。DNA吸收254nm的紫外辐射并传递能量给EB，而EB本身在302nm和366nm处有光吸收.吸收的能量在590nm处释放，并表现为橙红色荧光。结合的EB的荧光产率远大于游离EB的荧光产率。EB结合量的多少与DNA的大小和构型有关，而荧光强度正比于嵌入溴化乙锭的量.对于单一构型的同种DNA样品来说，溴化乙锭的嵌入量与样品溶液的DNA含量成正比。
二、材料、试剂及器具
1、标准DNA样品：已知浓度的线型DNA,以TE稀释为梯度浓度的一系列标准样品。
2、质粒DNA的酶切样品（待测)
3、溴化乙锭（EB）5μg/ml:以PH8。0的TE稀释10mg/ml母液而的。
4、紫外透射仪.
三、操作步骤
黑色塑料板（或其他替代物）
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在其上点上两排溴化乙锭2μl液滴，每排六点
↓
取标准样品2μl与第一排溴化乙锭混匀,则各点的DNA浓度分别为
（单位：ng/μl）：20、15、10、5、2、1
↓
取待测样品经过梯度稀释后，各加2μl于第二排的溴化乙锭上混匀
梯度稀释（单位：μl）
↓
把以上塑料板放到紫外投射仪的样品台上
↓
关好样品室门.以短波紫外光激发荧光.观察每一点的荧光强度或拍照。
比较上下两排得亮度,确定待测样品的浓度
四、注意事项
1、标准样品含单一种类的DNA，且大小与待测样品相近。
2、待测样品和标准样品使用同样的体积.
3、EB具有中度毒性、强致癌性,操作时切记戴手套,切勿沾染到衣物、皮肤、眼晴、口鼻等。
4、沾有EB的用具使用完毕统一集中于回收容器中，经净化处理后方可弃。
五、实验报告
1、绘出所观察到的现象(以点的密度代表亮度）
2、请估算待测DNA原液的浓度.
要求记录测定原始数据,计算待测样品的浓度和纯度;并对你的实验结果作出评价，提出下一步提纯工作的设想。琼脂糖凝胶电泳检测DNA
采用1%的琼脂糖进行电泳，实验步骤为:
a.制胶：称取0。2g琼脂糖转入三角瓶中，加入20mL1×TAE，混匀，于微波炉中加热融化。稍冷却后，加入1μLEB溶液（10mg/mL），倒入预先插入梳子的凝胶槽(12cm×12cm）内。待胶凝固后，竖直拔出梳子；
b。上样：在水平电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，将凝胶槽转移到电泳槽（HE—120，上海天能科技有限公司)中,保证缓冲液的液面高于凝胶表面。在封口膜上将5μLDNA样品和1μL6×loadingbuffer混合均匀，然后小心的加入到凝胶的点样孔中.Marker为λDNA/HindIII，上样量为5μL。