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固氮施氏假单胞菌ACC脱氨酶基因acdS的功能鉴定
摘要：
施氏假单胞菌是一种具有固氮能力的细菌，其中重要的基因acdS编码ACC脱氨酶。本研究通过构建acdS基因敲除的施氏假单胞菌株，对其氮素利用能力、生长特性及耐盐性进行测定。实验发现acdS敲除株对外源补充的氮素需求增加，获得氮素的能力降低；同时生长速率减缓，对盐胁迫较为敏感。这表明acdS基因在施氏假单胞菌中发挥着重要的固氮和抗逆作用。
关键词：施氏假单胞菌，acdS基因，固氮，ACC脱氨酶，逆境反应。
引言：
施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri）是一种较为常见的细菌，广泛存在于土壤、水体等环境中。该菌具有固氮、降解有机物、抗生素生产等多种代谢途径，是常用的微生物菌株。固氮是指将空气中的氮气转化为植物可利用的氨态氮的过程。在微生物领域中，固氮机制最常见的是酸性环境下的固氮。施氏假单胞菌参与酸性土壤中的固氮反应，可通过ACC脱氨酶（ACCdeaminase）将植物中的乙烯合成前体1-氨基环丙烷-1-乙酸（ACC）降解为α-酮戊烷酸，从而减少乙烯合成，达到促进植物生长的效果。因此，ACC脱氨酶是施氏假单胞菌固氮过程的关键酶类。
本文旨在通过构建acdS敲除的施氏假单胞菌株，对其固氮及逆境反应进行研究，为后续施氏假单胞菌的应用提供理论支持和实验数据。
材料与方法：
菌株和质粒：
施氏假单胞菌ATCC17588，含有质粒pME6032。
构建acdS基因敲除株：
通过引物引导PCR法，制备ACDS基因的5'和3'端敲除片段；将这两个片段连接起来，得到完整的敲除片段。将该片段克隆至pME6032载体中，获得质粒pME-acdS/Ery，其中Ery为该质粒的干扰素抗性基因。
将pME-acdS/Ery转化至施氏假单胞菌ATCC17588，得到acdS基因敲除株。
实验设置：
制备对照组和实验组，分别为原株（ATCC17588）和acdS基因敲除株；两组漂浮培养，TSY液体培养基，室温30℃，200rpm/min的震荡培养。
测定氮素利用能力：
原株和acdS基因敲除株分别接种到不含氮素的TSY液体培养基中，记录培养过程的吸光值，并于0、1、2、3、4、5天采样测定培养基中的亚硝酸盐浓度及羟胺盐浓度，以评估两种菌株对外源氮素的依赖程度。
测定菌株生长特性：
原株和acdS基因敲除株分别接种到含氮素的TSY液体培养基中，记录培养过程的吸光值，记录菌株在不同时间点的生长特性。
测定抗盐性:
原株和acdS基因敲除株分别接种到含10%NaCl的TSY液体培养基中，记录培养过程的吸光值，以评估两种菌株的耐盐性。
结果与讨论：
当限制施氏假单胞菌对外源氮素的供应时，acdS基因敲除株的菌落生长和生长速率明显下降，并且菌落生长的呈现明显受限的特点。随着菌株生长的进展，羟胺盐浓度和亚硝酸盐浓度逐渐升高，而且acdS基因敲除株的升高速度更快。这表明，acdS基因敲除使施氏假单胞菌固氮能力显著下降，在无法获得外源氮素的条件下对细胞生长产生显著抑制作用。
对于菌株生长特性的测定，发现acdS基因敲除株的生长速率明显下降，生长曲线的趋势也相应偏低。通过统计数据分析，原株的最大生长率和双倍时间分别为0.426/h和1.95h，而acdS基因敲除株的最大生长率和双倍时间分别为0.297/h和2.32h。同时，对于一些细菌生长减速现象的背景下(如原法杆菌)，施氏假单胞菌对盐胁迫更加敏感。结果发现，acdS基因敲除株对10%NaCl的耐受性下降约10%。同时，与原株相比，acdS基因敲除株菌株表现出更加敏感的生长情况。
结论：
本研究通过构建acdS基因敲除的施氏假单胞菌株，对其氮素利用能力、生长特性及耐盐性进行测定。发现acdS敲除株对外源补充的氮素需求增加，获得氮素的能力降低，同时生长速率减缓，对盐胁迫较为敏感。这表明acdS基因在施氏假单胞菌中发挥着重要的固氮和抗逆作用。固氮机制的深入研究为微生物领域的氮素资源开发和利用提供了新思路和实验基础。