双重PCR和竞争性PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系建立.docx

双重PCR和竞争性PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系建立
双重PCR和竞争性PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系建立
植物病原菌是造成植物病害的主要原因之一，尤其是马铃薯和番茄等经济作物的生产，由于不良天气、土壤质量、施肥等原因容易造成病菌的滋生，也严重影响到了农业的生产和经济效益。其中马铃薯环腐病和黑胫病是马铃薯种植中最为常见的病害之一，因为病害的病原菌很难通过肉眼直接观察，所以如何准确、快速、低成本的检测和鉴定这些病原菌就显得尤为重要。本论文主要介绍双重PCR和竞争性PCR技术在马铃薯环腐病菌和黑胫病菌的检测中的应用及其建立的技术体系。
一、马铃薯环腐病和黑胫病的病因
马铃薯环腐病和黑胫病都是由革兰阴性细菌引起的。马铃薯环腐病是由环腐菌引起的病害，主要侵入植物的根和茎，拥有恶臭、渗液和坏死等特点。黑胫病的病原菌是黑胫菌，常生长在土壤中，在温暖湿润的环境下迅速繁殖，侵染植物的地下部分，损坏植株的根、茎和叶片，导致叶片变黄、干枯和植株倒伏、死亡。
二、PCR技术及其应用
PCR（PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应）技术是20世纪80年代初发展起来的一种强大的分子生物学技术。即使只有DNA的微量量，因此不用通过传统的培养方法，就可以从任何生物材料中扩增出感兴趣的DNA区段。PCR技术在生物领域已经被广泛应用，包括分子诊断，基因表达定量，基因突变分析等。在植物病理学上，PCR技术也得到了广泛的应用，特别是在基因工程和品种选育中，PCR技术提供了诊断病原菌、检测多重感染、种质资源保存、筛选抗性等功能。
三、双重PCR技术
双重PCR技术是一种较为简单和经济的PCR技术，主要是在一个反应管中同时进行两个PCR扩增反应。其原理是利用两个不同的引物，在同一反应管中用于扩增两个不同的靶序列。这种技术可以提高PCR扩增的特异性，减少假阳性的可能性。
四、竞争性PCR技术
对于水稻条纹枯病、水稻纹枯病、棉花叶部病、龙船花叶斑病等一些病害，其所有不同类型的病原菌基因序列都比较相似，但每个亚型间的差异相对比较大，因此需要精确地识别和鉴定病原菌。竞争性PCR技术也是一种常用的鉴定病原菌的方法。竞争性PCR可以在一个反应管中同时扩增一个细菌的靶DNA和一个包含一个构建在同一靶序列中的内标序列（比如人类β-actin）的引物对。在PCR反应中，普通引物对和内标引物对竞争靶DNA的合成，当PCR反应平衡的时候，桥接靶DNA和内标序列的比例几乎相等。使用内标引物，可以在同一反应管中内部标准，即可以检测出不同病原菌数量的变化率。
五、双重PCR和竞争性PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌
基于双重PCR技术和竞争性PCR技术，可以利用多个靶序列或特异性引物对同一个DNA区段进行多次扩增，从而更好地鉴定和检测病原菌。
1.样本的制备
从感染植物的根、茎和叶片中，收集不同的样品，约重30-40mg，将其放入离心管中，加入1.5ml的TE缓冲液(pH8.0)，进行分离。
2.DNA的提取和纯化
使用快速提取植物基因组DNA的方法，分别提取样品中的DNA，将其纯化后分离成纯净DNA，去除干扰物质。
3.靶DNA区段的扩增
为了准确检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌的靶DNA区段，需要使用特异性引物扩增。
具体引物序列如下:
环腐菌引物
RpoDf:5′-GCT(G/T)(A/G)T(C/T)AA(C/T)T(C/T)GAAGGC-3′
RpoDr:5′-GGTAGCCATGGCGTCGCATG-3′
黑胫菌引物
T4:5′-GGTGGTATGTTGG/CATGGTG-3′
T5:5′-CTGCCGTTGAACCCAGGACC-3′
4.双重PCR的程序
双重PCR的体系一般包括两个PCR反应在同一反应管中。分别是具有环腐菌引物的PCR反应和具有黑胫菌引物的PCR反应。在这种扩增体系中，添加相关的模板DNA和成熟的引物。
反应体系以0.2mlPCR管为基本单位，同时反应区域有两个，因此体系里面可以分别加入以下反应物：
（1）1μLDNA提取样品。
（2）随即注入PCR扩增反应溶液，最后将试管密封。
利用热循环PCR仪进行反应，PCR反应程序的步骤如下：
第一步：DNA的解链（拓展）：95℃15min
第二步：环腐菌引物的PCR反应：95℃45s，55℃50s，72℃45s，共循环30次。
第三步：黑胫菌引物的PCR反应：95℃45s，55℃50s，72℃45s，共循环30次。
第四步：慢降温加固：72℃5min
第五步：静置：4℃
5.竞争性PCR的程序
竞争性PCR反应通过加入竞争引物实现。同样，反应也是在0.2ml的PCR管中，根据实际需要先加入适量的模板DNA、目标DNA的专一性扩增引物，内标引物、内标引物专一性扩增引物。
程序的