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单端孢菌素诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的作用机制研究
摘要：
单端孢菌素（Monorden）是一种从俄罗斯枸杞（LyciumruthenicumMurr.）叶中提取得到的天然产物，已被证明具有一定的抗肿瘤活性。本研究针对人肝癌细胞HepG2，通过体外实验研究了单端孢菌素对其凋亡的作用机制，结果发现单端孢菌素可通过激活ROS/JNK信号通路、调控Bcl-2家族蛋白表达等方式诱导HepG2细胞凋亡。本研究结果为单端孢菌素作为一种潜在的抗肝癌药物的进一步研究提供了理论依据。
关键词：单端孢菌素；HepG2；凋亡；ROS/JNK信号通路；Bcl-2家族蛋白
Abstract：
MonordenisanaturalproductextractedfromtheleavesofLyciumruthenicumMurr.inRussia,whichhasbeenprovedtohavecertainanti-tumoractivity.ThisstudyaimedtoinvestigatethemechanismofMonordeninducingapoptosisinhumanlivercancercellsHepG2throughinvitroexperiments.TheresultsshowedthatMonordencouldinduceHepG2cellapoptosisbyactivatingtheROS/JNKsignalingpathway,regulatingtheexpressionofBcl-2familyproteins,etc.ThisstudyprovidesatheoreticalbasisforfurtherresearchonMonordenasapotentialanti-livercancerdrug.
Keywords:Monorden;HepG2;apoptosis;ROS/JNKsignalingpathway;Bcl-2familyproteins
导言：
肝癌是一种常见的恶性肿瘤，全球范围内仍然是一个严重的健康问题。尽管当前治疗手段已经取得了巨大的进展，但肝癌的治疗仍然面临着很多挑战。因此，寻找肝癌的新型治疗方法已经成为一个热点研究领域。近年来，越来越多的天然产物被证明具有一定的抗肿瘤活性，并被广泛地用于肿瘤的治疗。其中，单端孢菌素是从俄罗斯枸杞（LyciumruthenicumMurr.）叶中提取得到的一种天然产物，已被证明有抗肿瘤的作用，但其作用机制仍未完全明确。因此，本研究旨在通过体外实验研究，探究单端孢菌素对人肝癌细胞HepG2的凋亡作用机制。
材料与方法：
1.细胞培养：
人肝癌细胞HepG2细胞系在37°C的无CO2培养箱内，使用DMEM（Gibco，美国）添加10%（v/v）的胎牛血清（Gibco，美国）、100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素（Sigma-Aldrich，美国）维持培养，呈培养稳定状态。
2.细胞毒性实验：
MTT法：将HepG2细胞分别置于96孔细胞培养板中，细胞密度为1×10^5个/ml，盛有100μl的DMEM，然后根据实验设计加入不同浓度的单端孢菌素（0、2.5、5、10、20、40、80μM）处理24小时。加入MTT试剂，孵育4小时后，添加DMSO。读取微孔板在490nm波长下吸光度。
3.细胞凋亡实验：
AnnexinV-FITC/PI双荧光染色法：将HepG2细胞分别置于6孔细胞培养板中，细胞密度为1×10^5个/ml，盛有2ml的DMEM，然后根据实验设计加入不同浓度的单端孢菌素。接着加入AnnexinV-FITC和PI双荧光染色试剂，并用流式细胞仪检测凋亡情况，并进行荧光染色。
4.氧自由基（ROS）生成实验：
DCFH-DA试剂：制备HepG2细胞单层，补充1%FBS含DMEM（2mL/孔），使用DCFH-DA染料（10μM）进行预处理30min。然后加入不同浓度的单端孢菌素，培养30min，然后收集样本并加20%的甲醇溶液定格，离心并取出上清液。使用荧光光谱法检测上清液活性氧。
5.WesternBlot实验：
将不同浓度的单端孢菌素处理的HepG2细胞收集后，按照惯例的方法提取蛋白，将其从12%SDS-PAGE胶中传递到PVDF膜上。接着用不同的抗体如Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleavedcaspase-3等进行WesternBlot技术分析。
结果：
1.单端孢菌素可以显著抑制HepG2细胞的生长，且呈现一定的剂量依赖性。
2.单端孢菌素可以诱导HepG2细胞凋亡，并呈现剂量效应关系。
3.单端孢菌素可以显著提高HepG2细胞内ROS水平，并通过激活JNK信号通路诱导细胞凋亡。
4.单端孢菌素可以调控Bcl