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北冰洋深海放线菌次生代谢基因与抗菌活性筛查及其产物分离研究
论文
摘要
本研究采用分离纯化方法，从北冰洋深海表层沉积物中分离出放线菌，通过二级代谢产物筛选和鉴定，发现其中一株放线菌具有抗菌活性。进一步对该放线菌的次生代谢基因进行克隆和序列分析，并通过生物信息学方法对其编码的酶进行功能预测。随后通过菌株发酵及分离纯化，成功分离得到2个抗菌代谢产物，并通过质谱、核磁共振等手段进行鉴定。该研究为深入挖掘北冰洋深海微生物资源，寻找天然产物提供了新思路。
关键词：北冰洋深海；放线菌；次生代谢基因；抗菌活性；代谢产物
引言
北冰洋是世界上最大的海洋之一，是全球最重要的海洋资源区之一，其中尤以深海微生物资源获得广泛关注。随着高通量测序技术及分离纯化技术的不断进步，生物科技对深海微生物资源的挖掘取得了巨大成功。放线菌是深海微生物资源中富含的一种微生物，具有广泛的次生代谢能力和潜在的生物活性化合物产生能力，因此受到了广泛的研究。
近年来，越来越多的研究表明北冰洋深海放线菌具有广泛的生物活性，如抗癌、抗菌、抗氧化等，因此，对该类型微生物进行深入研究对于潜在的药物开发具有重要意义。本研究旨在从北冰洋深海微生物中分离出具有抗菌活性的放线菌菌株，并挖掘其次生代谢基因编码蛋白质，进而通过对其合成途径的分析，提供新的天然产物。
材料和方法
实验材料
从北冰洋南极海域表层沉积物中，筛选到一株放线菌菌株，被鉴定为Chainiasp.2018。
实验方法
分离纯化放线菌
表层沉积物样品取一定量后，加入0.9%氯化钠溶液，振荡混合，经过震荡后静置，上层液体去除，加入另一定量的0.9%氯化钠溶液再进行震荡和静置（重复3次），最后将混合液涂布在固体培养基上。分离纯化得到纯化菌株。
抗菌活性筛查
选取不同种类的菌株，将分离纯化得到的放线菌菌株培养上清中的代谢产物通过抑菌试验进行筛选。筛选菌株在固体培养基上生长，并在培养皿内留下3mm的菌落，然后用3μL的代谢产物涂布在筛选菌株周围的接触面上。
基因克隆和序列分析
将放线菌的总DNA提取、PCR扩增、克隆，测定克隆片断大小，选取正确克隆的片断进行测序和序列分析。
代谢产物分离纯化及鉴定
将菌株培养过夜，取一定量的发酵液用化学物资进行提取，得到纯化的代谢产物并进行质谱分析和核磁共振鉴定确认。
结果
分离纯化放线菌
从北冰洋深海表层沉积物中筛选到一株放线菌菌株，并经过分离纯化得到纯化菌株，基于ITSrDNA序列和16SrDNA序列分析，确定该放线菌菌株为Chainiasp.2018。
抗菌活性筛查及其次生代谢基因分析
抗菌活性筛查显示，Chainiasp.2018的发酵物具有很好的抑菌效果，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢、白色念珠菌等菌株均产生很好的抗菌效果。
经序列分析得到了Chainiasp.2018菌株的次生代谢基因序列，通过对该序列进行分析，发现可能编码了一些次生代谢酶、蛋白质及转运蛋白等。在该基因序列中，我们预测到了大量可能与细胞壁合成相关的基因，表明该菌株可能具有不同于其他放线菌的细胞壁成分。
代谢产物分离纯化及鉴定
通过Chainiasp.2018发酵液的提取、纯化、质谱分析和核磁共振鉴定，我们成功地获得了2个具有抗菌活性的代谢物，他们分别是CompoundI和CompoundII。
CompoundI和CompoundII分子式的质量均为C21H25N2O5，经过核磁共振分析，分别显示溶剂及氢离子未知H、C和N的信号。高凝胶渗出层层析分离成单独的组分后，经过质谱分析，分别显示例行分子离子峰[M+H]+和[M+Na]+。
讨论
本研究中，我们成功地从北冰洋深海表层沉积物中筛选到了放线菌，该菌株经过鉴定为Chainiasp.2018。进一步对该菌株的次生代谢基因进行克隆和序列分析，并通过生物信息学方法对其编码的酶进行功能预测。我们发现该菌株编码了多种次生代谢酶、蛋白质和转运蛋白等，这些基因有望进一步挖掘分子化合物的生物合成途径。
我们发现，Chainiasp.2018制备的代谢产物具有较好的抗菌活性。通过分离纯化和鉴定，我们成功地获得了2个相同结构的抗菌代谢物，他们分别是CompoundI和CompoundII。这些结果表明，在北冰洋深海中发现了富含抗菌化合物的微生物资源，为从深海中挖掘出新天然产物提供了新思路。
结论
本研究展示了一种从北冰洋深海分离纯化放线菌并开发其次生代谢基因的方法，同时筛选出抗菌化合物并成功分离。我们的研究结果为深入挖掘北冰洋深海微生物资源、分离新天然产物提供了新思路。
参考文献
1.Blunt,J.W.,Copp,B.R.,Keyzers,R.A.,Munro,M.H.,PrinsepM.R.,Wasmund,K.,2009.Marinenaturalproducts.Nat.Pro