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切花菊悬浮细胞培养与再生体系建立研究
摘要：
为了建立切花菊悬浮细胞培养与再生体系，本文利用玉米素（2,4-D）、吲哚丁酸（IAA）、茉莉酸（NAA）等不同激素组合对切花菊花茎进行培养，筛选获得了最佳的诱导悬浮细胞的激素配比，即玉米素0.5mg/L，吲哚丁酸0.5mg/L，茉莉酸0.1mg/L。在此基础上，利用该配比在液体MS培养基上进行悬浮细胞的生长和增殖，并探究了巨噬细胞素C（LPS）和多糖多肽（PSK）等外源生长因子对菊花悬浮细胞增殖的作用。最后，成功培养出了具有分化潜能的菊花悬浮细胞，并利用基因枪法将外源DNA载体导入其中，成功实现了切花菊悬浮细胞的遗传转化和再生。
关键词：切花菊；悬浮细胞；培养；激素；增殖；再生
1.引言
切花菊（ChrysanthemummorifoliumRamat）是中国重要的观赏花卉之一，其具有丰富的形态特征和生物学意义，但由于传统繁殖方式的限制，其育种进展缓慢，制约了其广泛应用。悬浮细胞培养是一种高效的细胞培养技术，可在不依赖于性状的遗传背景下进行育种，并能够在获得遗传变异的同时，得到高产、高效、优质的育种材料。因此，建立切花菊悬浮细胞培养与再生体系，对于切花菊的育种与遗传研究具有重要意义。
2.实验材料与方法
2.1实验材料
切花菊茎段、2,4-D、IAA、NAA、MS培养基、15mL离心管、植物生长箱、悬浮细胞培养器、基因枪、LPS、PSK等物品。
2.2方法
2.2.1切花菊茎段的培养
将切花菊茎段切成约2cm长的段，用75%酒精消毒后，用无菌的重金属环夹持住花茎的基部，并在培养箱中进行培养基的诱导。
2.2.2激素诱导组合的筛选
在液体MS培养基上加入2,4-D、IAA、NAA等不同激素组合，每组培养15个菊花茎段。培养40d后，挑选出生长较好，组织生长旺盛的菊花茎段，测量其悬浮细胞增殖质量。
2.2.3悬浮细胞的培养与增殖
将经过筛选的激素组合投入液体MS培养基中，用15mL离心管培养菊花悬浮细胞，溶液pH调节至5.8，接种密度为0.2g/mL。在植物生长箱中设置温度、光照、湿度，以利于悬浮细胞的生长。经4周的生长，将菊花悬浮细胞分装至新的液体MS培养基中继续培养，生长至其密度为0.5g/mL左右时，投加适量的LPS和PSK刺激生长，观察其对悬浮细胞分裂增殖的影响。
2.2.4基因枪法转化与再生
将合成的外源DNA载体载入基因枪，采用基因枪法将载体导入菊花悬浮细胞中，利用农杆菌伴侣载体介导转移，将菊花加以培养。在去离子水中洗涤农杆菌，于耐药性培养基上培养车前草愈伤组织，制备出农杆菌感染液。将感染液滴于每个含菊花悬浮细胞的离心管中，继续培养至悬浮细胞周围出现愈伤组织，进行筛选和鉴定。
3.结果与分析
3.1激素诱导组合的筛选
经过对不同激素组合的筛选，得到最佳的诱导悬浮细胞的激素配比为：玉米素0.5mg/L、吲哚丁酸0.5mg/L、茉莉酸0.1mg/L。该配方不仅具有良好的悬浮细胞增殖率，而且可以促进菊花悬浮细胞的分化和表达特定的酶类基因，为后续的细胞遗传转化提供了基础条件。
3.2悬浮细胞的培养与增殖
在建立的液体MS培养基中，通过对悬浮细胞生长条件的控制，获得了具有分化潜能的菊花悬浮细胞。通过LPS、PSK等生长因子的刺激，悬浮细胞增殖达到了最大值，此时悬浮细胞生长旺盛、形态正常。通过分析其细胞结构、生长速率、细胞生长曲线等方面的指标，证实了该配比对切花菊悬浮细胞的生长具有很强的刺激和促进作用。
3.3切花菊悬浮细胞的基因遗传转化和再生
利用基因枪法将外源DNA载体直接载入切花菊悬浮细胞核中，成功实现了切花菊悬浮细胞的遗传转化和再生。经过初步鉴定，转化植物切花菊对抗草忍相对稳定，为进行基因育种打下了坚实的基础。
4.结论
本文采用不同激素组合对切花菊茎段进行培养，成功筛选出最佳诱导悬浮细胞的配方，并在此基础上建立了液体MS培养基上的菊花悬浮细胞培养和增殖体系，并探究了外源生长因子对其增殖的影响。同时，成功实现了切花菊悬浮细胞的遗传转化和再生，为通过基因育种提高其优良性状打下了坚实的基础。本文的研究结果对于推动切花菊的育种和生产具有一定的现实指导意义。