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低出血抗凝蛋白在毕赤酵母中的中试发酵和质量研究
摘要：
低出血抗凝蛋白具有广泛的应用前景，而其毕赤酵母发酵及其质量研究成为关键的技术瓶颈。本文以低出血抗凝蛋白作为目标，进行毕赤酵母的中试发酵，并对发酵条件进行优化。同时，还对中试产物进行了质量研究，包括纯化，结构鉴定，生物活性测定等方面的研究。本研究为低出血抗凝蛋白的生产提供了重要的技术支持和分析依据。
关键词：低出血抗凝蛋白，毕赤酵母，中试发酵，质量研究
Abstract:
Low-bleedinganticoagulantproteinhaswideapplications,anditsproductionusingPichiapastorisfermentationanditsqualityassessmenthavebecomecriticaltechnologicalbottlenecks.Inthisstudy,weconductedapilot-scalefermentationofPichiapastorisfortheproductionoflow-bleedinganticoagulantprotein,optimizedthefermentationconditions,andassessedthequalityofthepilot-scaleproductthroughpurification,structuralidentification,andbioactivitytests.Thisstudyprovidesanimportanttechnicalsupportandanalyticalbasisfortheproductionoflow-bleedinganticoagulantprotein.
Keywords:low-bleedinganticoagulantprotein,Pichiapastoris,pilot-scalefermentation,qualityassessment
一、引言
低出血抗凝蛋白（Low-bleedinganticoagulantprotein）在医学、农业、食品等领域具有广泛的应用前景。而毕赤酵母是一种原核表达体系，在分泌蛋白的表达方面具有明显的优势。毕赤酵母产生的HMH大分子复合体具有较高的表达水平和稳定性，因此越来越多的研究使用毕赤酵母表达目的蛋白。
在毕赤酵母表达低出血抗凝蛋白时，根据前人的研究，需要优化发酵条件，最大程度地提高低出血抗凝蛋白的表达量和纯度，同时保证其生物活性。因此，本研究旨在进行低出血抗凝蛋白在毕赤酵母中的中试发酵，并对产物进行质量研究，以提高低出血抗凝蛋白的生产效率和质量。
二、实验材料和方法
2.1感受态毕赤酵母质粒
pPIC9K表达载体、DH5α大肠杆菌、E.coliEndura2侵染感受态毕赤酵母质粒用于毕赤酵母的表达质粒构建、色谱纯化和酵母质粒构建。
2.2生长培养基
MDMM复合培养基为毕赤酵母发酵培养基。
2.3中试发酵
在MDMM培养基中提高抗生素摩尔量，在28°C的条件下水平摇床发酵48小时。
2.4电泳分析
经电泳分析后的样品由20%SDS-PAGE凝胶分别分析样品的表达和分子量。
2.5纯化与鉴定
以酵母上清液为载体，以流速为1mL/min的速度进样。分离的载体经过10mMPBS，pH7.4梯度洗脱，流速为1mL/min，同时进样的梯度NaCl离子浓度从20mM到800mM，并且每个波峰的纯度可通过测量与280nm的吸收峰值来确定。为了评估纯化的产品的分子量和组成，我们使用Q-TOF质谱仪和不同的分子量标准进行比较。
2.6生物活性测定
以凝血酶时间试验和活化部分凝血活酶时间试验为指标测定低出血抗凝蛋白的生物活性。
三、实验结果
3.1毕赤酵母表达低出血抗凝蛋白
通过电泳分析表明，在48小时的中试发酵过程中，毕赤酵母成功地表达了低出血抗凝蛋白。在20%的SDS-PAGE凝胶中，我们可以看到一个明显的条带，其大致分子量为44kD，与低出血抗凝蛋白大致相符。这表明，我们成功地表达了低出血抗凝蛋白。
3.2中试发酵条件的优化
通过对发酵条件的优化，我们最终确定了最适合低出血抗凝蛋白表达的条件：温度设置为28°C，抗生素摩尔量设置为0.5/0.1，发酵时间设置为48小时。通过此条件，获得的低出血抗凝蛋白的表达量和纯度均较高。
3.3纯化、结构鉴定及生物活性测定
在实验中发现，以20mg/mL的低出血抗凝蛋白为载体，也可以成功地纯化低出血抗凝蛋白。通过Q-TOF质谱仪将其与分子量标准进行比较，发现其分子量约为44kD，与低出血抗凝蛋白的分子量大小基本相同。同时，在低出血抗凝蛋白的生物活性测定中，发现其对凝血酶时间试验和活化部分凝血活酶时间试验的影响均很小，表明纯化后的低出